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5018

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 求助DGGE染色问题

各位：小弟最近跑DGGE，不知道是哪里出问题，PCR产物的琼脂糖电泳条带都非常亮，但是跑DGGE的时候染色完后都出现一片明亮的条带，已经不是一次了，而且我同学也有这种情况出现，请各位帮忙分析下。使用的是super greenI染色，1.5微升用1XTAE稀释10000倍表面涂抹染色两次，每次15分钟。DNA模板为去年9月份提取的昆虫肠道总DNA，－20摄氏度保存，有反复冻融现象，如果是DNA问题，但是PCR产物使用琼脂糖检测都是非常好的条带。下面有附图

[ Last edited by 5018 on 2011-4-23 at 17:31 ]

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一杯香茗，一卷书，偷得半日闲散；一抹斜阳，一壶酒，愿求半世逍遥。

1楼2011-04-22 13:54:54

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caisanrenju

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
5018(金币+5): 2011-04-30 21:57:12
lstt09nk(金币+5): 不错~~ 2011-05-05 18:25:09

1. 想详细问一下梯度。如果第一张破了的胶浓度是30-70的话，建议楼主用35-60。50的浓度，不太确定能不能完全分开。
2. 看LZ说电泳的电压时间有120V，16h，不知道哪张胶是这个条件。如果是下边两个，估计问题就在这里了。告诉你一个秘密，电压乘以电泳时间（h）的乘积等于1000，是最好的。
3. PCR产物非特异带太多，一定要改进PCR条件，提高退火温度，最好降落PCR，然后再进行纯化
4. 还想问一下胶的浓度是多少（聚丙烯酰胺的浓度）？还有就是可否告知测的是哪一区的基因，因为看你的PCR产物<200bp（如果Mark是100bp的话），有点奇怪