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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊

表达载体构建好以后，转化进pET29a，从转化子中重新提取质粒，发现质粒大小部队了，打了大约600bp，但是酶切验证还是有我连上去的目的片段，太纠结了！！
有没有给解释下的啊~~~
郁闷中
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1楼2011-04-13 11:38:07
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-13 16:20:14
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-13 21:22:14
你提取出来的重组质粒大小很有可能会变化，因为质粒在菌中的形态是变化的，你可以做酶切验证，然后跑电泳验证，跑电泳的时候可以将你当时酶切质粒和酶切的基因也点上作为对照，这样如果条带正确那么重组质粒也是没有任何问题的！
当然了也可以用你提取出来的质粒作为模板进行PCR验证你的目的基因。

祝好运！
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2楼2011-04-13 13:47:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-13 16:21:12
你是不是直接拿刚提取的质粒跑胶看大小了？
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3楼2011-04-13 15:46:45
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-13 15:46:45:
你是不是直接拿刚提取的质粒跑胶看大小了？

刚提取的质粒跑胶是不是对胶上片段大小有影响啊？
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4楼2011-04-13 16:21:59
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
xiaoyu1014126(金币+2): 2011-04-13 20:26:54
amisking(EPI+1): good！ 2011-04-13 21:23:25
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-13 16:21:59:
刚提取的质粒跑胶是不是对胶上片段大小有影响啊？

拿刚提的质粒跑胶检测大小是不准确的。常用的DNA Marker只能标定线性DNA的大小，而提取的质粒有环状、开环、线性三种类型，所以跑胶时会开到三条带。好像现在有卖专门标定质粒的Marker了，不过我还没用过。因此要确定一个质粒的大小只有经过单酶切后再跑胶才可以。另外从不同细胞里提出的同一种质粒带型一般也是不同的
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5楼2011-04-13 16:57:18
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csdyg

木虫 (正式写手)
最终目的做表达的质粒最好测序
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6楼2011-04-14 02:52:25
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