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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】克隆T载体
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alexguo221

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】克隆T载体 已有4人参与

最近在做克隆，准备将PCR产物直接连到T载体上。
pcr产物是在低熔点的胶上直接割胶回收的。
严格按照protocol上的步骤。
转化，涂板，鉴定。
细菌能长起来，但酶切鉴定就是没有我插进去的目的片段。
这是怎么回事，那我插进去的是什么呢。

T载体用的是TAKARA的PMD18T
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世道再难，也要呼吸顺畅。
1楼 2011-03-29 17:32:12
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-29 18:10:11
难道没放抗性素。其实这种假阳性很常见的，多鉴定几个就行了。其实可以先菌P的，我们实验都这样筛选的。最后还酶切不对，就再连一次了。还有有些聚合酶好像产物后面不加A的哦
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2楼2011-03-29 17:47:55
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+2): 感谢交流，再接再厉 2011-03-29 20:07:20
pMD18-T可以用蓝白斑筛选，选白斑做菌落PCR后有阳性带的估计就是了。再一个如果插入片断大的话，你可以试试16度连接时间长一些，建议2Kb以上连接1-2小时。
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hehe
3楼2011-03-29 18:25:01
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2011-03-29 18:25:01:
pMD18-T可以用蓝白斑筛选，选白斑做菌落PCR后有阳性带的估计就是了。再一个如果插入片断大的话，你可以试试16度连接时间长一些，建议2Kb以上连接1-2小时。

我的连接时间没有问题。我连几百KB的都差不进去
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世道再难，也要呼吸顺畅。
4楼2011-03-29 19:43:10
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2011-03-29 17:47:55:
难道没放抗性素。其实这种假阳性很常见的，多鉴定几个就行了。其实可以先菌P的，我们实验都这样筛选的。最后还酶切不对，就再连一次了。还有有些聚合酶好像产物后面不加A的哦

你好抗生素放了。我用的是rtaq酶是带A的。
我有时候挑十几个都是一样的情况。愁死了
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世道再难，也要呼吸顺畅。
5楼2011-03-29 19:44:28
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-03-30 09:46:10
还有一种可能，你胶回收没做好，回收产物有没有检测过。或者你PCR产物就不是你想要的片段也说不定，毕竟都长菌落过程都正常。反正片段不大，你送测序看看吧，时间浪费不起的。

[ Last edited by zgb1982 on 2011-3-30 at 00:09 ]
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6楼2011-03-30 00:05:45
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得还是多挑几个菌，转化的时候蓝白斑筛选会好些
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一直向前！
7楼2011-03-30 13:08:55
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