24小时热门版块排行榜    

查看: 871  |  回复: 6

alexguo221

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】克隆T载体 已有4人参与

最近在做克隆,准备将PCR产物直接连到T载体上。
pcr产物是在低熔点的胶上直接割胶回收的。
严格按照protocol上的步骤。
转化,涂板,鉴定。
细菌能长起来,但酶切鉴定就是没有我插进去的目的片段。
这是怎么回事,那我插进去的是什么呢。

T载体用的是TAKARA的PMD18T
回复此楼
世道再难,也要呼吸顺畅。
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流,欢迎常来 2011-03-29 18:10:11
难道没放抗性素。其实这种假阳性很常见的,多鉴定几个就行了。其实可以先菌P的,我们实验都这样筛选的。最后还酶切不对,就再连一次了。还有有些聚合酶好像产物后面不加A的哦
2楼2011-03-29 17:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 感谢交流,再接再厉 2011-03-29 20:07:20
pMD18-T可以用蓝白斑筛选,选白斑做菌落PCR后有阳性带的估计就是了。再一个如果插入片断大的话,你可以试试16度连接时间长一些,建议2Kb以上连接1-2小时。
hehe
3楼2011-03-29 18:25:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alexguo221

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2011-03-29 18:25:01:
pMD18-T可以用蓝白斑筛选,选白斑做菌落PCR后有阳性带的估计就是了。再一个如果插入片断大的话,你可以试试16度连接时间长一些,建议2Kb以上连接1-2小时。

我的连接时间没有问题。我连几百KB的都差不进去
世道再难,也要呼吸顺畅。
4楼2011-03-29 19:43:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alexguo221

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2011-03-29 17:47:55:
难道没放抗性素。其实这种假阳性很常见的,多鉴定几个就行了。其实可以先菌P的,我们实验都这样筛选的。最后还酶切不对,就再连一次了。还有有些聚合酶好像产物后面不加A的哦

你好抗生素放了。我用的是rtaq酶是带A的。
我有时候挑十几个都是一样的情况。愁死了
世道再难,也要呼吸顺畅。
5楼2011-03-29 19:44:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-03-30 09:46:10
还有一种可能,你胶回收没做好,回收产物有没有检测过。或者你PCR产物就不是你想要的片段也说不定,毕竟都长菌落过程都正常。反正片段不大,你送测序看看吧,时间浪费不起的。

[ Last edited by zgb1982 on 2011-3-30 at 00:09 ]
6楼2011-03-30 00:05:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我觉得还是多挑几个菌,转化的时候蓝白斑筛选会好些
一直向前!
7楼2011-03-30 13:08:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 alexguo221 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见