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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！
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鬼笔坏坏

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！ 已有23人参与

怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！
我是从青霉菌里提的，开始用的SDS法，液氮研磨+500ul抽提缓冲液65℃水浴1h后，12000离心10min，加两次氯仿：异戊醇（24：1）后离心10Min,12000收集上清，加等体积异丙醇-20放置30min以上，13500离心，用75%乙醇洗无菌风吹干后加无菌水溶的，结果跑电泳只有RNA。然后做了好多次都这样。又换的氯化苄法，（液氮研磨0.1g+500ul缓液+125uLDE 10%SDS+300uL氯化苄，50℃，1h）做这个我连醋酸钠PH都调到5.2了，结果还是没有。就崩溃了,麻烦高手给指导一下！！！

[ Last edited by 1949stone on 2011-4-21 at 12:54 ]
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1楼 2011-03-28 18:52:28
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冼亮淀粉酶

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1949stone(金币+4): 考虑epi 2011-04-21 12:58:23
楼主上图，提取得到的样品的电泳图，看看有没有什么RNA和DNA，别忘了点上两个ladder，λ 线性DNA用于指示青霉DNA，1kb DNA 用于指示RNA。当然，如果有经验了，就点上这两个中的一个就可以了。附上我的一张电泳图，第一个泳道是λ 线性DNA大概四十多KB，泳道2、3、4共三个是真菌基因组DNA，可以看得到在λ 线性DNA相似大小的地方有一条亮带，那就是真菌基因组DNA；在泳道前面部分有一大堆长长的是RNA。



[ Last edited by 冼亮淀粉酶 on 2011-4-15 at 23:58 ]
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
20楼2011-04-15 23:37:54
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冼亮淀粉酶

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1949stone(EPI+1): 哈哈 epi来也 2011-04-21 12:58:46
如果有了RNA，当然就是表示已经破胞成功了，因为细胞内才有RNA。

我用的抽提液配方为
成分        浓度
NaCl        200mmol/L
EDTA-Na2        4mmol/L
SDS        2%
Tris-HCl(pH=8.0)        100mmol/L

与你的不一样，我用的方法和你的也不一样
2.4.14.1真菌总DNA的提取
（1）接种菌株至液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3天；
（2）用灭菌纱布过滤，并压干菌体；
（3）将菌丝体倒入研钵（灭菌并预冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末状；
（4）将粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液；
（5）加等体积苯酚/氯仿，轻轻倒转混合，10000rpm离心10min；
（6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重复步骤（5）之后以等体积氯仿抽提一次；
（7）取上清液，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
（8）10000rpm 离心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥；
（9）以20µL 1×TE 溶解沉淀；
（10）电泳检测总DNA的浓度。
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22楼2011-04-16 14:36:31
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冼亮淀粉酶

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西瓜(金币+2, EPI+1): 热心、专业 2011-04-20 23:11:06
“我是从青霉菌里提的，开始用的SDS法，液氮研磨+500ul抽提缓冲液65℃水浴1h后，12000离心10min，加两次氯仿：异戊醇（24：1）后离心10Min,12000收集上清，加等体积异丙醇-20放置30min以上，13500离心，用75%乙醇洗无菌风吹干后加无菌水溶的，结果跑电泳只有RNA。”

青霉和曲霉我都提取过，加起来超过50个菌株，都能提取成功且作为模板PCR出来产物。我对这些步骤有点想法：
1、“65℃水浴1h”这个步骤我不知道起什么作用，是不是想热胀冷缩反复冻融加速真菌破胞？我在建宏基因组文库提取DNA的时候也没有用过那么高的温度。如果是想这样，就不必了，因为液氮研磨结束之后再高温也没用。当然我也只是猜测这一步是想达到这个效果，其实我是真的不知道设计这个步骤的人想要达到怎样的效果。
2、异丙醇只加了总体积的1/50，其作用是使得上下相分层更加清晰，这个添加量对蛋白质没有任何变性作用。我用异丙醇提取淀粉酶的时候加了十倍于酶液体积才能把蛋白质全都沉淀下来，而且沉淀再溶解的时候蛋白质损失很少的，所以别寄望于异丙醇能使得蛋白质变性。氯仿能使蛋白质变性，虽然效果比异丙醇好很多，但是也不能全部变性。真正能使蛋白质变性的是酚类，所以我才用1/4的苯酚（1/4的氯仿，1/2的含DNA的混合液）。我懒得加异丙醇。一般抽提可以两次，之后再加1/2的氯仿把苯酚萃取干净，这样可以把蛋白质去除得较好。
3、异丙醇可以用来沉淀DNA，而且沉淀出来也是絮状的。我在建宏基因组文库的时候DNA是用乙醇来沉淀的，把DNA过凝胶层析柱，洗脱液滴到乙醇里，有了DNA就马上沉淀，这些含有很少腐殖酸的DNA可以用枪头挑出来重新溶解跑胶。异丙醇当然也是可以沉淀RNA的，所以跑电泳的时候也有RNA。
4、多糖也可能会被异丙醇沉淀下来，假如用75%乙醇洗过，风干的DNA像是白色结块，不能完全溶解，不要紧，只要将其完全打散，再在50度水浴锅充分溶解，之后放到4度去冷冻，再高速离心去除沉淀取上清液就行。如果还想除去更多，可以在-20度过夜，结冰之后低温溶解，再高速离心取上清液就行。DNA可溶，所以不会损失太多的。这个沉淀不一定是白色，如果真菌产了孢子有了颜色，提取DNA的时候把孢子也用了，那么色素会有残留，这时候白色沉淀就是有了色素的颜色，但是不影响PCR。
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23楼2011-04-16 15:08:43
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西瓜(金币+2): 热心 2011-04-20 23:10:34
液氮研磨之前菌丝体越干越好，干的才能磨成粉末，湿的加了液氮之后会成一块贴着研钵，不过我很少通过真空干燥弄干菌丝，每次都是挤得差不多就行了，都是成一块贴着研钵的，但是很少有一次提不出来的。我加了提取液到磨完菌丝的研钵里之后还用研棒把菌丝洗下来，吸取到EP管里之后不离心，直接抽提。我不知道是否应该离心之后取上清液抽提，没做过对比实验，不知道是否有差别，反正已经能提取出来，就不费那个心了。
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26楼2011-04-17 16:58:22
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dhd997(金币+2): 太热心 了 2011-04-21 08:48:16
两三天过去了，楼主提取得怎样了？
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28楼2011-04-20 22:39:16
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所以我认为苯酚应该加，除非有什么我现在还不知道的特殊要求。
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30楼2011-04-20 23:15:15
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dhd997(金币+3): good 2011-04-21 18:44:34
饱和酚是要避光的，你在想，你有没有试一下照着我的方法做一次？各个步骤都严格按照我的，我觉得可能就成功了，要不然就只能再讨论了。
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33楼2011-04-21 14:35:41
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引用回帖:
1275701楼: Originally posted by 鬼笔坏坏 at 2012-08-30 11:33:32
嘻嘻，真不好意思，好久好久不上小木虫了，我最后提出来了，就是加大菌丝体量，然后尽量干，就好了。最后也发了几篇文章，顺利毕业，顺利找了份不错的工作，已经工作了一段了，谢谢你！谢谢每一位这的每一位虫友！ ...

厉害
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51楼2012-08-30 14:20:53
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