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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】该死的酶切
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alexguo221

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】该死的酶切 已有5人参与

用BamH1酶切载体和一段500左右的PCR产物，连接重组质粒后，提取鉴定。
还是用bamH1切。理应是出来的片段是500左右的。但是除了载体的条带外，在1.5K处还有一条很亮的条带。跟载体的亮度是一致的。
最近总是遇到莫名其妙的问题，不知道怎么回事。

请帮帮忙


可以确定载体里没有其他的bamh1位点了
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世道再难，也要呼吸顺畅。
1楼 2011-03-11 22:40:49
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-03-12 09:30:43
就是说你载体和PCR片段都有2个BamHI位点咯？
难道是连接的时候，3个PCR片段连在一起的概率也很大了？刚好1.5k。。。
如果我没理解错，建议克隆用2种酶吧

BTW，酶切验证时候500bp的目的条带有吗

[ Last edited by gongeleven on 2011-3-11 at 23:42 ]
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2楼2011-03-11 23:39:10
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-12 09:30:53
1 ，推荐用两种酶切连接
2，你单酶切连接应该要做载体去磷酸化处理，不知道你做了没
3，PCR产物直接酶切连接有时候不靠谱，可以先TA连接到T载体或者平末端载体。然后酶切下来连目标载体。
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3楼2011-03-12 09:27:39
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poog502

木虫 (正式写手)
双酶切保险

设计加酶切位点的引物重扩，双酶切

[ Last edited by poog502 on 2011-3-12 at 09:32 ]
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4楼2011-03-12 09:31:10
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-03-11 23:39:10:
就是说你载体和PCR片段都有2个BamHI位点咯？
难道是连接的时候，3个PCR片段连在一起的概率也很大了？刚好1.5k。。。
如果我没理解错，建议克隆用2种酶吧

BTW，酶切验证时候500bp的目的条带有吗

[ Last e ...

已经做了去磷酸化。
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世道再难，也要呼吸顺畅。
5楼2011-03-12 10:38:34
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-03-11 23:39:10:
就是说你载体和PCR片段都有2个BamHI位点咯？
难道是连接的时候，3个PCR片段连在一起的概率也很大了？刚好1.5k。。。
如果我没理解错，建议克隆用2种酶吧

BTW，酶切验证时候500bp的目的条带有吗

[ Last e ...

但是很奇怪的一点是1.5KB的条带很亮，跟载体差不多。不像是切下来的。这是怎么回事，我酶切的时间挺短的
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世道再难，也要呼吸顺畅。
6楼2011-03-12 10:41:33
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j2

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是很奇怪耶，就算是PCR产物连一起了，酶切也能切开啊~~~
关注~~~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
7楼2011-03-12 10:42:52
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