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billowzeng

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶切无结果 已有7人参与

我有一段1000bp左右PCR回收产物进行酶切,但是酶切4小时后通过3%的琼脂糖凝胶电泳,什么也没有,请问这可能是什么原因呢。
酶切体系:
H2O 3ul
DNA 12ul(<1ug)
BSA 2ul
Buffer 2ul
酶 1ul
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yabxxh

木虫 (正式写手)

★ ★
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:10:18
请问用的是哪个公司的酶,没猜错的话应该是TAKARA,
体系没有问题,反应温度有没有弄错,发生这种情况很可能是产生了星号活性,把DNA切碎了,温度没问题的话建议酶切时间短一些,看看效果
2楼2010-12-21 16:35:53
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rioarsenal

金虫 (正式写手)

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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-22 00:00:22
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-22 11:47:44
引用回帖:
Originally posted by billowzeng at 2010-12-21 16:19:27:
我有一段1000bp左右PCR回收产物进行酶切,但是酶切4小时后通过3%的琼脂糖凝胶电泳,什么也没有,请问这可能是什么原因呢。
酶切体系:
H2O 3ul
DNA 12ul(<1ug)
BSA 2ul
Buffer 2ul
酶 1ul

第一,回收以后要电泳检测质量的,不知怎么样;

第二,样品和水中是否混有DNAase

第三,用的什么酶,好好看看操作手册的注意事项
3楼2010-12-21 22:26:34
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wangdandelia

木虫 (正式写手)


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酶切之前的DNA样品上样检测了吗?多少微升上样呢?我觉得可能是你的DNA浓度太低了,还有就是琼脂糖凝胶加入染色剂了吗?比如EB。
4楼2010-12-22 09:33:41
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dhmdddd

木虫 (正式写手)


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回收之后DNA浓度怎么样啊?有没有可能是浓度太低了酶切后再回收就收集不到了呢?
上班族,学习ing……
5楼2010-12-22 09:45:38
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billowzeng

金虫 (正式写手)

Takara酶Msp I ,按操作说明操作的,通过PCR仪保持温度37度。
回收以后电泳检测质量与DL2000 marker比较,约在50ng/L左右
6楼2010-12-22 11:14:49
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billowzeng

金虫 (正式写手)

酶切之后电泳DL2000是很明显的。请问星号活性该怎么避免呢,H2O与DNA里应该没有DNAase,因为DNA放了一个月后电泳还是有条带,而H2O用来做PCR效果很好。
7楼2010-12-22 11:18:41
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wangy0908

金虫 (正式写手)

★ ★
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silicare(金币+1):正解 2010-12-22 11:48:34
应该是你的DNA的浓度太低了!或者你的酶切回收不好的。多做两次的吧
8楼2010-12-22 11:45:06
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tian1203

银虫 (著名写手)


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可能是质粒浓度太低,1000bp有可能是切下来没看到。以前也出现过这种情况
别紧张,我不是什么好人...
9楼2010-12-22 11:51:00
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