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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切无结果
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billowzeng

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶切无结果 已有7人参与

我有一段1000bp左右PCR回收产物进行酶切，但是酶切4小时后通过3%的琼脂糖凝胶电泳，什么也没有，请问这可能是什么原因呢。
酶切体系：
H2O 3ul
DNA 12ul(<1ug)
BSA 2ul
Buffer 2ul
酶 1ul
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1楼 2010-12-21 16:19:27
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:10:18
请问用的是哪个公司的酶，没猜错的话应该是TAKARA，
体系没有问题，反应温度有没有弄错，发生这种情况很可能是产生了星号活性，把DNA切碎了，温度没问题的话建议酶切时间短一些，看看效果
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2楼2010-12-21 16:35:53
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-22 00:00:22
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-22 11:47:44
引用回帖:
Originally posted by billowzeng at 2010-12-21 16:19:27:
我有一段1000bp左右PCR回收产物进行酶切，但是酶切4小时后通过3%的琼脂糖凝胶电泳，什么也没有，请问这可能是什么原因呢。
酶切体系：
H2O 3ul
DNA 12ul(<1ug)
BSA 2ul
Buffer 2ul
酶 1ul

第一，回收以后要电泳检测质量的，不知怎么样；

第二，样品和水中是否混有DNAase

第三，用的什么酶，好好看看操作手册的注意事项
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3楼2010-12-21 22:26:34
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶切之前的DNA样品上样检测了吗？多少微升上样呢？我觉得可能是你的DNA浓度太低了，还有就是琼脂糖凝胶加入染色剂了吗？比如EB。
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4楼2010-12-22 09:33:41
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
回收之后DNA浓度怎么样啊？有没有可能是浓度太低了酶切后再回收就收集不到了呢？
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上班族，学习ing……
5楼2010-12-22 09:45:38
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billowzeng

金虫 (正式写手)
Takara酶Msp I ，按操作说明操作的，通过PCR仪保持温度37度。
回收以后电泳检测质量与DL2000 marker比较，约在50ng/L左右
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6楼2010-12-22 11:14:49
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billowzeng

金虫 (正式写手)
酶切之后电泳DL2000是很明显的。请问星号活性该怎么避免呢，H2O与DNA里应该没有DNAase，因为DNA放了一个月后电泳还是有条带，而H2O用来做PCR效果很好。
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7楼2010-12-22 11:18:41
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★
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silicare(金币+1):正解 2010-12-22 11:48:34
应该是你的DNA的浓度太低了！或者你的酶切回收不好的。多做两次的吧
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8楼2010-12-22 11:45:06
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tian1203

银虫 (著名写手)
★
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可能是质粒浓度太低，1000bp有可能是切下来没看到。以前也出现过这种情况
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别紧张，我不是什么好人...
9楼2010-12-22 11:51:00
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