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麦兜响当当

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办

pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？
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1楼 2011-03-10 19:21:58
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★ ★
麦兜响当当(金币+10): thank you very much!实验条件和试剂材料都没有问题，除了室温年前年后这个可能不一样，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-03-12 15:33:39
引用回帖:
Originally posted by 麦兜响当当 at 2011-03-10 19:21:58:
pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？

年前可以，年后不行，可能的原因太多了:
1) 你是否已经排除了所有试剂因素，包括连接酶，载体等等。比如其他人用这些酶或者载体成功过了吗？
2）你重复试验了吗？
3）感受态细胞是否存在问题？

这些都确定没问题了，再考虑其他问题。
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2楼2011-03-10 19:25:06
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sofili

银虫 (小有名气)
???
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3楼2011-03-12 10:36:36
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phoenix211

金虫 (小有名气)
多连会，我们一般都十六度过夜。
换一批感受态，可能就好了。
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4楼2011-03-12 11:10:51
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tw7921

铜虫 (初入文坛)
连的时间有点短，如果用的solution1还可以，用的T4要过夜。
另外最可能的就是感受态的效率过低
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5楼2011-03-12 12:15:18
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
有可能感受态时间长效率太低！
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6楼2011-03-12 14:43:24
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woshishao

金虫 (初入文坛)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-12 15:34:46
麦兜响当当(金币+5): ExTaq，用的solution1,按说明书是1小时，可是连接不上，能再帮忙分析一下吗？ 2011-03-12 19:37:22
能问问你用的什么酶扩增的cDNA？问这个问题的目的在于：看是否是PCR产物末端加A问题。若没有，就检查一下你的体系。5U/ml和1U/ml的T4酶用16℃连接4小时以上，用产品自带solution1就看说明书了。
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7楼2011-03-12 15:05:51
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anika

新虫 (初入文坛)
我觉得该看一下片段有没有降解！最近我也碰到这个问题！---个人建议
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8楼2011-03-12 20:47:17
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
翱宇(金币+1): 鼓励交流！ 2011-03-13 15:40:46
麦兜响当当(金币+5): 2011-03-15 09:09:25
长片段我都是4度连接24h
片段放久了，末端的A会掉，你重新纯化看看
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9楼2011-03-12 20:53:09
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yabing0324

金虫 (职业作家)
重新做吧，找原因太费事费劲
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10楼2011-03-12 21:48:05
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
粘性末端还是平末端?试试碱性磷酸酶处理载体吧
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11楼2011-03-12 23:01:11
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cauzhangtao

木虫 (正式写手)
pcr完了产物不要时间太长
估计是载体坏了
呵呵
ta克隆
载体的那个T很容易丢失的
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12楼2011-03-12 23:55:33
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
多长算长啊？我10K的怎么办啊？
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13楼2011-03-13 11:22:02
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woshishao

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-15 12:23:31
连接T载体的构建要注意的几点：
1.使用EXTAQ或TAQ扩增完CDNA后，片段末端是有A的，这个时候尽快胶回收，做上与 T载体的连接，至少不要把PCR产物或回收后产物放置2天以上，因为我们这里出现过可能末端A丢失的情况。
2.了解一下你的T载体使用情况，看看同实验室其他人最近有成功构建过没，如果没有，你还要考虑下T载体降解问题。对于这个问题，我要补充的是，一般有人会从产品原装吸取的T载体进行稀释后使用，但是我们这里的经验是：稀释后的T载体在以后的使用中，降解情况非常明显，常做不出来，可能是保存问题。所以，你也可以从原装T载体中吸取少量来做。
3其次，我把我们这里用的T载体连接的材料和方法说下，希望对你有帮助。
我们用的T载体是PMD-19 T，是takara的产品。我用的体系是参照说明书的，我是直接取用原装T载体，效果一直还可以。
祝楼主早日解决问题！实验顺利！
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14楼2011-03-14 21:33:46
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AniterZhao

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果是用高保真酶的话 ，可能不能用T4ligase连接，换用特异的连接酶
另外也建议长片段16℃连接过夜
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15楼2011-03-15 15:40:31
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
学习了。一般用自带solutionI连接，基本都能连上
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16楼2011-03-15 16:08:51
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威斯布鲁克

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
会不会是载体的问题，换个载体试试，实验室也有个师姐被困住了，正在换载体ing
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17楼2012-02-10 13:47:11
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lichunmeinb1

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by AniterZhao at 2011-03-15 15:40:31
如果是用高保真酶的话 ，可能不能用T4ligase连接，换用特异的连接酶
另外也建议长片段16℃连接过夜

为什么用高保真酶，不能用T4ligase连接啊
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18楼2015-03-11 10:08:00
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