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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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麦兜响当当

金虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办

pMD 19与长片段cDNA连接,16度1h(或4度过夜),年前能连接上,现在连不上了,有人在做相关实验吗?能回答一下吗?
有人建议连接时间延长,可信吗?
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)


★ ★
麦兜响当当(金币+10): thank you very much!实验条件和试剂材料都没有问题,除了室温年前年后这个可能不一样,can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-03-12 15:33:39
引用回帖:
Originally posted by 麦兜响当当 at 2011-03-10 19:21:58:
pMD 19与长片段cDNA连接,16度1h(或4度过夜),年前能连接上,现在连不上了,有人在做相关实验吗?能回答一下吗?
有人建议连接时间延长,可信吗?

年前可以,年后不行,可能的原因太多了:
1) 你是否已经排除了所有试剂因素,包括连接酶,载体等等。比如其他人用这些酶或者载体成功过了吗?
2)你重复试验了吗?
3)感受态细胞是否存在问题?

这些都确定没问题了,再考虑其他问题。
2楼2011-03-10 19:25:06
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sofili

银虫 (小有名气)


3楼2011-03-12 10:36:36
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phoenix211

金虫 (小有名气)


多连会,我们一般都十六度过夜。
换一批感受态,可能就好了。
4楼2011-03-12 11:10:51
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tw7921

铜虫 (初入文坛)


连的时间有点短,如果用的solution1还可以,用的T4要过夜。
另外最可能的就是感受态的效率过低
5楼2011-03-12 12:15:18
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)


有可能感受态时间长效率太低!
6楼2011-03-12 14:43:24
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woshishao

金虫 (初入文坛)


★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-12 15:34:46
麦兜响当当(金币+5): ExTaq,用的solution1,按说明书是1小时,可是连接不上,能再帮忙分析一下吗? 2011-03-12 19:37:22
能问问你用的什么酶扩增的cDNA?问这个问题的目的在于:看是否是PCR产物末端加A问题。若没有,就检查一下你的体系。5U/ml和1U/ml的T4酶用16℃连接4小时以上,用产品自带solution1就看说明书了。
7楼2011-03-12 15:05:51
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anika

新虫 (初入文坛)


我觉得该看一下片段有没有降解!最近我也碰到这个问题!---个人建议
8楼2011-03-12 20:47:17
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sai00fuji

金虫 (正式写手)



翱宇(金币+1): 鼓励交流! 2011-03-13 15:40:46
麦兜响当当(金币+5): 2011-03-15 09:09:25
长片段我都是4度连接24h
片段放久了,末端的A会掉,你重新纯化看看
9楼2011-03-12 20:53:09
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yabing0324

金虫 (职业作家)


重新做吧,找原因太费事费劲
10楼2011-03-12 21:48:05
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)


粘性末端还是平末端?试试碱性磷酸酶处理载体吧
11楼2011-03-12 23:01:11
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cauzhangtao

木虫 (正式写手)


pcr完了产物不要时间太长
估计是载体坏了
呵呵
ta克隆
载体的那个T很容易丢失的
12楼2011-03-12 23:55:33
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cxl_yll

木虫 (正式写手)


多长算长啊?我10K的怎么办啊?
13楼2011-03-13 11:22:02
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woshishao

金虫 (初入文坛)


★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4): 鼓励交流,欢迎常来 2011-03-15 12:23:31
连接T载体的构建要注意的几点:
1.使用EXTAQ或TAQ扩增完CDNA后,片段末端是有A的,这个时候尽快胶回收,做上与 T载体的连接,至少不要把PCR产物或回收后产物放置2天以上,因为我们这里出现过可能末端A丢失的情况。
2.了解一下你的T载体使用情况,看看同实验室其他人最近有成功构建过没,如果没有,你还要考虑下T载体降解问题。对于这个问题,我要补充的是,一般有人会从产品原装吸取的T载体进行稀释后使用,但是我们这里的经验是:稀释后的T载体在以后的使用中,降解情况非常明显,常做不出来,可能是保存问题。所以,你也可以从原装T载体中吸取少量来做。
3其次,我把我们这里用的T载体连接的材料和方法说下,希望对你有帮助。
我们用的T载体是PMD-19 T,是takara的产品。我用的体系是参照说明书的,我是直接取用原装T载体,效果一直还可以。
祝楼主早日解决问题!实验顺利!
14楼2011-03-14 21:33:46
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AniterZhao

铁虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果是用高保真酶的话 ,可能不能用T4ligase连接,换用特异的连接酶
另外也建议长片段16℃连接过夜
15楼2011-03-15 15:40:31
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zgb1982

木虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
学习了。一般用自带solutionI连接,基本都能连上
16楼2011-03-15 16:08:51
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威斯布鲁克

铁虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
会不会是载体的问题,换个载体试试,实验室也有个师姐被困住了,正在换载体ing
17楼2012-02-10 13:47:11
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lichunmeinb1

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by AniterZhao at 2011-03-15 15:40:31
如果是用高保真酶的话 ,可能不能用T4ligase连接,换用特异的连接酶
另外也建议长片段16℃连接过夜

为什么用高保真酶,不能用T4ligase连接啊
18楼2015-03-11 10:08:00
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