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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
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麦兜响当当

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办

pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？
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1楼 2011-03-10 19:21:58
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woshishao

金虫 (初入文坛)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-12 15:34:46
麦兜响当当(金币+5): ExTaq，用的solution1,按说明书是1小时，可是连接不上，能再帮忙分析一下吗？ 2011-03-12 19:37:22
能问问你用的什么酶扩增的cDNA？问这个问题的目的在于：看是否是PCR产物末端加A问题。若没有，就检查一下你的体系。5U/ml和1U/ml的T4酶用16℃连接4小时以上，用产品自带solution1就看说明书了。
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7楼2011-03-12 15:05:51
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★ ★
麦兜响当当(金币+10): thank you very much!实验条件和试剂材料都没有问题，除了室温年前年后这个可能不一样，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-03-12 15:33:39
引用回帖:
Originally posted by 麦兜响当当 at 2011-03-10 19:21:58:
pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？

年前可以，年后不行，可能的原因太多了:
1) 你是否已经排除了所有试剂因素，包括连接酶，载体等等。比如其他人用这些酶或者载体成功过了吗？
2）你重复试验了吗？
3）感受态细胞是否存在问题？

这些都确定没问题了，再考虑其他问题。
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2楼2011-03-10 19:25:06
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phoenix211

金虫 (小有名气)
多连会，我们一般都十六度过夜。
换一批感受态，可能就好了。
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4楼2011-03-12 11:10:51
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tw7921

铜虫 (初入文坛)
连的时间有点短，如果用的solution1还可以，用的T4要过夜。
另外最可能的就是感受态的效率过低
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5楼2011-03-12 12:15:18
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