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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
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麦兜响当当

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办

pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？
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1楼 2011-03-10 19:21:58
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woshishao

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-15 12:23:31
连接T载体的构建要注意的几点：
1.使用EXTAQ或TAQ扩增完CDNA后，片段末端是有A的，这个时候尽快胶回收，做上与 T载体的连接，至少不要把PCR产物或回收后产物放置2天以上，因为我们这里出现过可能末端A丢失的情况。
2.了解一下你的T载体使用情况，看看同实验室其他人最近有成功构建过没，如果没有，你还要考虑下T载体降解问题。对于这个问题，我要补充的是，一般有人会从产品原装吸取的T载体进行稀释后使用，但是我们这里的经验是：稀释后的T载体在以后的使用中，降解情况非常明显，常做不出来，可能是保存问题。所以，你也可以从原装T载体中吸取少量来做。
3其次，我把我们这里用的T载体连接的材料和方法说下，希望对你有帮助。
我们用的T载体是PMD-19 T，是takara的产品。我用的体系是参照说明书的，我是直接取用原装T载体，效果一直还可以。
祝楼主早日解决问题！实验顺利！
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14楼2011-03-14 21:33:46
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★ ★
麦兜响当当(金币+10): thank you very much!实验条件和试剂材料都没有问题，除了室温年前年后这个可能不一样，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-03-12 15:33:39
引用回帖:
Originally posted by 麦兜响当当 at 2011-03-10 19:21:58:
pMD 19与长片段cDNA连接，16度1h（或4度过夜），年前能连接上，现在连不上了，有人在做相关实验吗？能回答一下吗？
有人建议连接时间延长，可信吗？

年前可以，年后不行，可能的原因太多了:
1) 你是否已经排除了所有试剂因素，包括连接酶，载体等等。比如其他人用这些酶或者载体成功过了吗？
2）你重复试验了吗？
3）感受态细胞是否存在问题？

这些都确定没问题了，再考虑其他问题。
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2楼2011-03-10 19:25:06
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phoenix211

金虫 (小有名气)
多连会，我们一般都十六度过夜。
换一批感受态，可能就好了。
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4楼2011-03-12 11:10:51
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tw7921

铜虫 (初入文坛)
连的时间有点短，如果用的solution1还可以，用的T4要过夜。
另外最可能的就是感受态的效率过低
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5楼2011-03-12 12:15:18
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