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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】6Kb的DNA片段怎么扩增啊？
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kinglong09

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】6Kb的DNA片段怎么扩增啊？

最近扩增一个约6kb的DNA片段，总扩不出来。我用的是Takara的LA Taq，产物经琼脂糖凝胶检测，一点都没有
请问，是怎么回事？
敬请各位虫友指点。
谢谢！
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1楼 2010-12-30 18:25:30
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
kinglong09(金币+2):谢谢参与
LA Taq我扩过最长的有5 K +,6 K可能有点悬，但也不一定是酶的问题，也有可能是引物的问题，或者退火温度的问题。将PCR条件优化下试试看。
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2楼2010-12-30 18:44:53
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+2):谢谢参与
6K有点长，再摸索下条件，设个温度梯度看看
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3楼2010-12-30 18:48:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
6k还好吧，呵呵，我都没有用LA taq ，都是用的Primer STAR，注意延伸时间的设置。
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4楼2010-12-30 19:56:09
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
楼主的模版是什么呢？
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6楼2010-12-30 20:16:20
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
6kbLA应该是可以的，我扩过7.5的，不过和材料的有关，我用的是植物DNA，扩长片段引物要长，退火温度要高一些，
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9楼2010-12-30 21:13:56
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
可以分段扩
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10楼2010-12-30 21:22:59
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s2006204023

木虫 (著名写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
直接向师兄师姐打听比较好
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11楼2010-12-30 22:03:48
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hyw1989960

木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
这个确实不好扩，模板一定要好
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12楼2010-12-30 22:10:04
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jerry110

新虫 (小有名气)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
用RACE可以吗？
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13楼2010-12-30 22:43:17
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
你的模板是啥？不过延伸时间得长一些，循环次数多一些！
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14楼2010-12-30 23:32:36
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kinglong09

木虫 (小有名气)
我用的材料是水稻叶片DNA
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15楼2011-01-02 15:18:49
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xzx135

铁杆木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
一般都是引物的设计问题，设计得好，P的就很容易，否则没什么其他的好办法。除非酶失活了。
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16楼2011-01-02 15:40:36
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小不点点

木虫 (著名写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
帮顶
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18楼2011-01-02 16:01:43
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小不点点

木虫 (著名写手)
帮顶
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20楼2011-01-02 16:25:44
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-11 16:13:26
LA  8k的都扩增出来过
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22楼2011-01-02 16:28:58
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
顶起
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23楼2011-01-02 16:31:57
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lhx00555

至尊木虫 (文坛精英)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
祝福!!
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2757901
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24楼2011-01-02 16:46:14
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-11 16:13:46
引用回帖:
Originally posted by kinglong09 at 2010-12-30 18:25:30:
最近扩增一个约6kb的DNA片段，总扩不出来。我用的是Takara的LA Taq，产物经琼脂糖凝胶检测，一点都没有
请问，是怎么回事？
敬请各位虫友指点。
谢谢！

用TakaRa的LA Taq扩增就行了，人家公司30多K的片段都做出来了呢！
我觉得关键要把握好扩增的条件，如6k的片段，退火55℃ 1min，延伸72℃ 5min试一下看看！
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25楼2011-01-02 19:20:21
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virus2009

金虫 (正式写手)
★ ★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-11 16:14:01
这个跟扩增使用的模板有关，你可以注意提取一份高纯度的DNA用于PCR。LA taq可以扩7K的！
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30楼2011-01-03 12:45:44
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翱宇

禁虫 (正式写手)
★ ★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):这个酶也不错 2011-01-11 16:14:22
我喜欢用TOYOBO的Kod-plus，这个酶68度延伸，基本上我扩增这么多片段没有错误的。建议楼主使用这个酶扩增下，另外检查引物的退火温度，尽量低一些！
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31楼2011-01-03 13:02:16
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soarfalcon8808

铁杆木虫 (职业作家)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
可以延长些时间呀
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33楼2011-01-10 14:04:42
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love_st

金虫 (著名写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
我扩过40kb的
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34楼2011-01-10 14:58:37
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
可以分段扩，然后最后再连起来
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35楼2011-01-10 15:15:53
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
换个公司的长片段酶试试
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36楼2011-01-10 15:56:09
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
延伸6分钟，模板浓度不要太高
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37楼2011-01-11 11:54:46
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gonglab-5

木虫 (小有名气)
★ ★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-11 16:14:42
kinglong09(金币+2): 2011-01-11 20:12:28
la我从动物细胞基因组扩15kb没问题
关键是
第一：模板的质量要高，用好的试剂盒提取基因组
第二：引物的特异性要好，否则扩不出来，可以适当增加引物的长度，但是尽量不要超过40nt
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38楼2011-01-11 12:48:27
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飘海一笑

新虫 (初入文坛)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
就用Pfu
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39楼2011-01-11 13:49:45
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
kinglong09(金币+2): 2011-01-11 20:12:35
还有一个关键因素就是你的模板里边不能有太多的复杂结构，否则什么酶都p不出来
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40楼2011-01-11 16:15:18
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kinglong09

木虫 (小有名气)
谢谢各位上面的各位虫友！
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41楼2011-01-11 20:12:08
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luzeyan

金虫 (小有名气)

原因很多

★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by kinglong09 at 2010-12-30 18:25:30:
最近扩增一个约6kb的DNA片段，总扩不出来。我用的是Takara的LA Taq，产物经琼脂糖凝胶检测，一点都没有
请问，是怎么回事？
敬请各位虫友指点。
谢谢！

换一种酶试试，或增加模板的用量，如果还扩增不出来就是引物的问题了，重设引物
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42楼2011-01-11 21:43:12
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CHONPaS

金虫 (初入文坛)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
takara 的LAtaq应该可以
不过要看楼主的模板的结构复杂不
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43楼2011-01-11 23:37:31
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
重要是用对酶
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44楼2011-01-17 21:09:34
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
6kb有点大了，不过也是可以的，你在试试引物，可能是引物的问题
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45楼2011-01-18 12:02:49
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by kinglong09 at 2010-12-30 18:25:30:
最近扩增一个约6kb的DNA片段，总扩不出来。我用的是Takara的LA Taq，产物经琼脂糖凝胶检测，一点都没有
请问，是怎么回事？
敬请各位虫友指点。
谢谢！

你的模板是什么啊，用质粒最好，从cDNA非常难扩，DNA还性。坚持一下，不行就用overlap的方法。
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46楼2011-01-18 14:59:39
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by gonglab-5 at 2011-01-11 12:48:27:
la我从动物细胞基因组扩15kb没问题
关键是
第一：模板的质量要高，用好的试剂盒提取基因组
第二：引物的特异性要好，否则扩不出来，可以适当增加引物的长度，但是尽量不要超过40nt

gonglab?农大的？呵呵
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47楼2011-01-18 15:04:00
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)
★
kinglong09(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
9楼: Originally posted by Arrennew at 2010-12-30 21:13:56
6kbLA应该是可以的，我扩过7.5的，不过和材料的有关，我用的是植物DNA，扩长片段引物要长，退火温度要高一些，

请问师兄，我也扩增植物cdna 大小在3K左右，老是扩不出来，请问有什么建议吗？
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48楼2013-04-20 09:30:23
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简单回复
zoujin1295楼
2010-12-30 20:11   回复  
kinglong09(金币+1):谢谢参与
^隐形的翅膀^7楼
2010-12-30 20:17   回复  
kinglong09(金币+1):谢谢参与
^隐形的翅膀^8楼
2010-12-30 20:18   回复  
rantjf17楼
2011-01-02 15:54   回复  
kinglong09(金币+1):谢谢参与
莫木19楼
2011-01-02 16:20   回复  
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windstory21楼
2011-01-02 16:26   回复  
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ychao26楼
2011-01-02 19:36   回复  
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小。芥子27楼
2011-01-02 20:05   回复  
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dashu-9733228楼
2011-01-02 20:28   回复  
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paulpaulzj29楼
2011-01-02 21:44   回复  
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071081113232楼
2011-01-10 13:59   回复  
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