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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切切不动
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ikaren2013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切切不动

我分别用TOYOBO和Fermentas的限制性内切酶做酶切反应，都切不开，是怎么回事啊？
ps:这个质粒是个重组体，我现在需要把上面的目的片段切下来，目的片段的大小约为670bp
我的对照设置得不好，缺少重组质粒不酶切的对照。以至于让虫友误认为我想得到pcDNA3.0上的片段了。实际上，我想得到的重组体上的目的基因片段。大概670bp。


质粒浓度    205ug/ml      OD260/280=1.90

TOYOBO
体系                             10ul
DNA(0.2ug/ul)               4ul
水                                  4ul
Buffer(10*)                    1ul
BamH I                        0.5ul
Xho I                           0.5ul
_____________________
37℃  6个小时

Fermentas
体系                              10ul
DNA(0.2ug/ul)                4ul
水                                   2.5ul
Tango  Buffer(10*)         2ul      (工作浓度为2*）
BamH I                           1ul     （要求Bam H I 为2倍）
Xho I                           0.5ul
_____________________
37℃  3个小时

以下是酶切结果图片
TOYOBO:
Fermentas:

[ Last edited by ikaren2013 on 2010-12-27 at 21:19 ]
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1楼 2010-12-27 00:22:59
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:04
ikaren2013(金币+1):谢谢！ 2010-12-27 21:19:22
质粒DNA减少到1μL试一下。
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2楼2010-12-27 01:08:13
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:17
减少你的DNA用量，增加酶用量的！以及你要注意酶的活性是否正常的？
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-12-27 07:00:45
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:28
先分别做个单酶切试试，看能切开不
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4楼2010-12-27 08:05:03
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
有可能没连上
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5楼2010-12-27 08:48:59
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duanming123

木虫 (正式写手)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
不用补水试试，就是质粒，buffer，酶，用宝生物的酶试试
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6楼2010-12-27 09:50:39
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
单切试试。 酶切时间长一点  dna少一点。
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7楼2010-12-27 09:51:55
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jerry110

新虫 (小有名气)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
酶切时间加长点，过夜处理试试
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8楼2010-12-27 09:56:16
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圣经我的梦

木虫 (职业作家)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
没连上？
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9楼2010-12-27 10:12:29
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2010-12-27 08:48:59:
有可能没连上

应该是连上了的，因为他的电泳里面有跑质粒的对照，所以应该是连接上了的！可能是体系不好或者用的试剂问题的。
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10楼2010-12-27 12:35:37
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feng__

金虫 (著名写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-27 23:24:55
我们做酶切都是20微体系，10微是不是少点
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11楼2010-12-27 13:11:54
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ladtalent

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-27 23:25:04
应该是切过了的 你怎么知道酶切下来呢 没切之前是环状的 切完事线性的所有跑的比较慢啊

另外弱弱地问下你要切下那个片段做什么？
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13楼2010-12-27 14:21:32
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-27 23:25:11
分别作单酶切，如果还切不开就换好一点的酶吧。单酶切如果都切不开肯定是酶的纯度不行了。
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14楼2010-12-27 15:02:38
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
ikaren2013(金币+1):谢谢您宝贵的建议 2010-12-27 21:00:16
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-27 23:25:24
也有可能是你已经切开了，但切开的小片段量太少了，大片段的荧光太强了，小片段就基本看不到了，增大曝光胶片看看。因为第二张图明显双切的片段要小了一点。关键是看你质粒片段有多大啦。
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15楼2010-12-27 15:09:11
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liminsun_0

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-27 23:25:38
要想酶切尽量完全一点，就要DNA量少一点，酶多一点，条件应该没问题，还要检查试剂的问题，切不动的时候同时做个单酶切和双酶切相同条件的对比实验看看结果再分析问题出在哪里。另外，问一下虫友们，酶切DNA都是提取克隆的质粒进行酶切的吗？有没有用直接菌落PCR产物做酶切的？
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16楼2010-12-27 15:54:53
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ikaren2013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liminsun_0 at 2010-12-27 15:54:53:
要想酶切尽量完全一点，就要DNA量少一点，酶多一点，条件应该没问题，还要检查试剂的问题，切不动的时候同时做个单酶切和双酶切相同条件的对比实验看看结果再分析问题出在哪里。另外，问一下虫友们，酶切DNA都是提 ...

酶切DNA不都是提取克隆的质粒进行酶切，有用直接菌落PCR产物做酶切的。我自己的这个很特殊，我是为了给目的片段换个载体。而我的目的片段本身又很特殊，是个已经做好了的突变的目的基因。
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17楼2010-12-27 21:12:06
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-27 23:25:56
首先还是测序吧！我遇到过相同的情况，本以为只是个别位点发生了突变，不以为意，测序结果却意外的显示质粒已经发生了相当严重的重组！
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18楼2010-12-27 21:24:32
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ciyang

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-27 23:26:04
首先检查一下你的酶切位点，有没有可能搞错了。（双酶切的时候比单酶切的时候明显要小一些，但是不多，感觉没有670）
再对一下你所使用的酶是不是正确的，有没有过期或是失活；
还有酶切没必要那么久最多3个小时就可以了，要是酶切鉴定我一般都30min的；
当然，你也要确定你拿到的原来的质粒是没问题的！
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19楼2010-12-27 21:26:10
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-27 23:26:14
看第二张图，你已经切开了，只不过你的片段太小，与载体比例差别太大，切1ug才切下几分之一的目的片段？要回收到我建议用200ul大体系切8ug,不要怕浪费，少试几次，一次做成。
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20楼2010-12-27 22:22:01
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1. 酶切不开或不完全
1.1 质粒问题 纯度差或残留酶切抑制物最为常见 。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，
1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
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21楼2012-04-17 22:30:58
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holywater

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
真笨呢！酶切切不动，可以用PCR反映来扩呀！ 还可以引入新酶切位点


笨笨笨死了
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22楼2012-04-18 15:21:26
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简单回复
zoujin12912楼
2010-12-27 13:41   回复  
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