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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切切不动
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ikaren2013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切切不动

我分别用TOYOBO和Fermentas的限制性内切酶做酶切反应，都切不开，是怎么回事啊？
ps:这个质粒是个重组体，我现在需要把上面的目的片段切下来，目的片段的大小约为670bp
我的对照设置得不好，缺少重组质粒不酶切的对照。以至于让虫友误认为我想得到pcDNA3.0上的片段了。实际上，我想得到的重组体上的目的基因片段。大概670bp。


质粒浓度    205ug/ml      OD260/280=1.90

TOYOBO
体系                             10ul
DNA(0.2ug/ul)               4ul
水                                  4ul
Buffer(10*)                    1ul
BamH I                        0.5ul
Xho I                           0.5ul
_____________________
37℃  6个小时

Fermentas
体系                              10ul
DNA(0.2ug/ul)                4ul
水                                   2.5ul
Tango  Buffer(10*)         2ul      (工作浓度为2*）
BamH I                           1ul     （要求Bam H I 为2倍）
Xho I                           0.5ul
_____________________
37℃  3个小时

以下是酶切结果图片
TOYOBO:
Fermentas:

[ Last edited by ikaren2013 on 2010-12-27 at 21:19 ]
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1楼 2010-12-27 00:22:59
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-27 23:26:14
看第二张图，你已经切开了，只不过你的片段太小，与载体比例差别太大，切1ug才切下几分之一的目的片段？要回收到我建议用200ul大体系切8ug,不要怕浪费，少试几次，一次做成。
赞一下(2人) 回复此楼
20楼2010-12-27 22:22:01
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:04
ikaren2013(金币+1):谢谢！ 2010-12-27 21:19:22
质粒DNA减少到1μL试一下。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-12-27 01:08:13
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:17
减少你的DNA用量，增加酶用量的！以及你要注意酶的活性是否正常的？
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-12-27 07:00:45
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★
ikaren2013(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:28
先分别做个单酶切试试，看能切开不
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2010-12-27 08:05:03
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