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ikaren2013

金虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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虫号: 786738

[交流] 【求助/交流】双酶切切不动

我分别用TOYOBO和Fermentas的限制性内切酶做酶切反应，都切不开，是怎么回事啊？
ps:这个质粒是个重组体，我现在需要把上面的目的片段切下来，目的片段的大小约为670bp
我的对照设置得不好，缺少重组质粒不酶切的对照。以至于让虫友误认为我想得到pcDNA3.0上的片段了。实际上，我想得到的重组体上的目的基因片段。大概670bp。

质粒浓度 205ug/ml    OD260/280=1.90

TOYOBO
体系                            10ul
DNA(0.2ug/ul)             4ul
水                               4ul
Buffer(10*)                   1ul
BamH I                      0.5ul
Xho I                         0.5ul
_____________________
37℃  6个小时

Fermentas
体系                            10ul
DNA(0.2ug/ul)             4ul
水                                  2.5ul
Tango  Buffer(10*)       2ul    (工作浓度为2*）
BamH I                         1ul    （要求Bam H I 为2倍）
Xho I                         0.5ul
_____________________
37℃  3个小时

以下是酶切结果图片
TOYOBO:
Fermentas:

[ Last edited by ikaren2013 on 2010-12-27 at 21:19 ]

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1楼 2010-12-27 00:22:59

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chibang1220

木虫 (著名写手)

应助: 42 (小学生)
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虫号: 1653055

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1. 酶切不开或不完全
1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，
1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换] 。