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ikaren2013

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】双酶切切不动

我分别用TOYOBO和Fermentas的限制性内切酶做酶切反应，都切不开，是怎么回事啊？
ps:这个质粒是个重组体，我现在需要把上面的目的片段切下来，目的片段的大小约为670bp
我的对照设置得不好，缺少重组质粒不酶切的对照。以至于让虫友误认为我想得到pcDNA3.0上的片段了。实际上，我想得到的重组体上的目的基因片段。大概670bp。

质粒浓度 205ug/ml    OD260/280=1.90

TOYOBO
体系                            10ul
DNA(0.2ug/ul)             4ul
水                               4ul
Buffer(10*)                   1ul
BamH I                      0.5ul
Xho I                         0.5ul
_____________________
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Fermentas
体系                            10ul
DNA(0.2ug/ul)             4ul
水                                  2.5ul
Tango  Buffer(10*)       2ul    (工作浓度为2*）
BamH I                         1ul    （要求Bam H I 为2倍）
Xho I                         0.5ul
_____________________
37℃  3个小时

以下是酶切结果图片
TOYOBO:
Fermentas:

[ Last edited by ikaren2013 on 2010-12-27 at 21:19 ]

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1楼 2010-12-27 00:22:59

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ikaren2013

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

Originally posted by liminsun_0 at 2010-12-27 15:54:53:
要想酶切尽量完全一点，就要DNA量少一点，酶多一点，条件应该没问题，还要检查试剂的问题，切不动的时候同时做个单酶切和双酶切相同条件的对比实验看看结果再分析问题出在哪里。另外，问一下虫友们，酶切DNA都是提 ...

酶切DNA不都是提取克隆的质粒进行酶切，有用直接菌落PCR产物做酶切的。我自己的这个很特殊，我是为了给目的片段换个载体。而我的目的片段本身又很特殊，是个已经做好了的突变的目的基因。