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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白原核表达求助
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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】蛋白原核表达求助

各位大侠：
大家好！
我要表达一水溶性蛋白，序列如下
“center]mkvsaallwl lliaaafspq glt" gpasvpt tccfnlanrk iplqrlesyr ritsgkcpqk
avifktklak dicadpkkrw vqdsmkyldq ksptpkp，共97个氨基酸。
用pet28质粒,BL21宿主菌表达，一直表达纯化不好，后来换用pmal-p4x质粒，TB1宿主菌表达，表达纯化仍然不好。
最近发现该蛋白的前23个氨基酸（引号划线部分）是信号肽，成熟的是没用这23个氨基酸的。请问各位大侠，这个蛋白表达纯化不出来，是否和这23个氨基酸的信号肽有关系呢？
请各位大侠赐教！
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1楼2010-11-26 17:19:32
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 18:48:05
序列中有起始密码子嘛？
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2楼2010-11-26 18:17:33
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 18:58:17
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 18:59:11
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 18:59:11
到底是表达不好还是纯化不好?
表达不好可能跟信号肽有关，纯化不好跟信号肽没关系的。
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3楼2010-11-26 18:34:42
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 18:49:09
28a载体用的酶切位点是啥？
如果是融合表达，大肠杆菌可能就不会把前面那段当成信号肽的。
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4楼2010-11-26 18:37:17
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-11-26 18:17:33:
序列中有起始密码子嘛？

有起始密码子Met
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5楼2010-11-26 18:48:53
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-11-26 18:37:17:
28a载体用的酶切位点是啥？
如果是融合表达，大肠杆菌可能就不会把前面那段当成信号肽的。

28a的酶切位点是EcoR1、Hind111，没有融合表达。
pmal-p4x有融合蛋白MBP，MBP后紧接着是我的蛋白
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6楼2010-11-26 18:57:53
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-11-26 18:34:42:
到底是表达不好还是纯化不好?
表达不好可能跟信号肽有关，纯化不好跟信号肽没关系的。

28a的酶切位点是EcoR1、Hind111，没有融合表达。28a表达不好，点杂交效果很不好，怀疑与信号肽有关。
pmal-p4x有融合蛋白MBP，MBP后紧接着是我的蛋白
，表达可以，点杂交很明显，但纯化不出来，过镍柱纯化后条带很杂，这和信号肽有关吗？
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7楼2010-11-26 19:02:35
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
建议你试一下rosetta gami B菌株。
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8楼2010-11-26 19:03:10
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D调华丽

木虫 (正式写手)
wmqouc(金币+1): 2010-11-26 19:12:40
wmqouc(金币+1): 2010-12-16 09:02:51
和信号肽有关的，你的蛋白是表达在胞外还是胞内？
如果在胞外，信号肽会被自动切除的
如果再胞内，信号肽就不一定被切了
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9楼2010-11-26 19:08:20
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wmqouc

金虫 (著名写手)
帖子别处沉了啊
自己顶一下
各路大侠帮忙看看啊，谢谢！
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10楼2010-11-27 14:24:45
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
纯化标签在什么位置？如果在信号肽前端的话会被切掉的，当然纯化不了
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11楼2010-11-27 16:54:24
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181587941

金虫 (正式写手)

是胞内表达吗

原核表达一般都是胞内的多吧？而且一般在包涵体内吧？不要没分泌出来，你当然纯化不到咯，你做个超声波破碎，看看包涵体内有没有>?
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12楼2010-11-28 20:44:06
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