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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序问题，求助高手。
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zhaohu200801

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】测序问题，求助高手。

做TA克隆时，测序结果只找到上游引物，找不到下游引物。经过BLast，相似度只有30%，不知道什么原因。
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1楼 2010-11-06 11:56:44
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yynzcx

银虫 (小有名气)
恭喜！恭喜！
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2565295
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2楼2010-11-06 12:43:14
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
zhaohu200801(金币+1):哦，谢谢 2010-11-06 18:12:06
zhaohu200801(金币+1):再送你一个 2010-11-06 18:21:57
测错了。 我测序也会遇到这样的。 假阳性克隆。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2567462&fpage=1
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3楼2010-11-06 15:01:54
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zhaohu200801

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-11-06 15:01:54:
测错了。 我测序也会遇到这样的。 假阳性克隆。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2567462&fpage=1

长出来的菌不多，而且还挺小的，那到底是什么原因造成的假阳性克隆啊？是简并引物设计的不对吗？还是模板的问题啊？都研三了，实验做了一年多了还没点进展，急！
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4楼2010-11-06 18:20:38
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-06 23:51:31
zhaohu200801(金币+1):谢谢 2010-11-07 14:19:10
引用回帖:
Originally posted by zhaohu200801 at 2010-11-06 18:20:38:

长出来的菌不多，而且还挺小的，那到底是什么原因造成的假阳性克隆啊？是简并引物设计的不对吗？还是模板的问题啊？都研三了，实验做了一年多了还没点进展，急！

1  感受态质量

2  连接效率

3  片段长短

4  抗生素浓度

5  其他操作


1235会造成假阳性，1-5会造成菌少且小。

克隆的不好，关引物设计什么事情。 引物设计的pcr产物，在连接前不应该有确认么？ 模板的确认也是pcr那步该做的。
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5楼2010-11-06 21:25:20
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胖无名

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-06 23:51:41
zhaohu200801(金币+1):谢谢 2010-11-07 14:19:36
这个原因可多了，1 你测序是测通还是单向，2 克隆的片段多大，如果片段较长而又是单向测序的话，只找到一个引物是不足为奇的，3 送去测序的样品有没有经过酶切验证或菌落PCR验证，4 你是哪家给测的序，测错也不是没有可能
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6楼2010-11-06 22:23:18
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zhaohu200801

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 胖无名 at 2010-11-06 22:23:18:
这个原因可多了，1 你测序是测通还是单向，2 克隆的片段多大，如果片段较长而又是单向测序的话，只找到一个引物是不足为奇的，3 送去测序的样品有没有经过酶切验证或菌落PCR验证，4 你是哪家给测的序，测错也不是 ...

我是测通，克隆片段不大，350bp左右，送去测序的样品经过了酶切验证和菌落PCR验证，都还不错，是华大基因公司给测的序，难道测错了？通过比对，相似度才只有30%。
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7楼2010-11-07 19:33:39
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zhaohu200801

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-11-06 21:25:20:


1  感受态质量

2  连接效率

3  片段长短

4  抗生素浓度

5  其他操作


1235会造成假阳性，1-5会造成菌少且小。

克隆的不好，关引物设计什么事情。 引物设计的pcr产物，在连接前不应该有确认 ...

pcr产物第一次没扩出来，二次扩增才扩出来，还挺亮的，关键是测序结果一比对，才只有30%左右的相似度，所以我才怀疑是在设计简并引物的时候出的问题，我克隆的是未知序列的基因。
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8楼2010-11-07 19:39:48
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love三人游

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我的也是华大测得，也是相似性很高，但是我得到反向互补序列之后相似性很高，策反了没有啊
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9楼2012-01-05 21:14:01
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