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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为何定量PCR扩增曲线不规则
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】为何定量PCR扩增曲线不规则 已有6人参与

各位兄弟姐妹，Taq-Man法检测我的目的基因，内参扩增曲线正常，但是目的基因扩增曲线不光滑，是什么原因啊？
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1楼 2010-10-16 17:16:55
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
                            如图

[ Last edited by apple6299 on 2010-10-16 at 17:18 ]
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2楼2010-10-16 17:17:16
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by apple6299 at 2010-10-16 17:17:16:
                            如图

[ Last edited by apple6299 on 2010-10-16 at 17:18 ]

是两步法，先提RNA反转成cDNA之后，才用我的目的基因进行扩增的！因为瞬时离心后，确保反应液全部在毛细管下部，可以排除毛细管有气泡的因素
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5楼2010-10-17 12:32:53
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sn198651 at 2010-10-16 18:37:50:
你的是一步法还是两步法啊
加体系的时候会不会离心管里有气泡

如果气泡很多 曲线肯定不规则

是两步法，先提RNA反转成cDNA之后，才用我的目的基因进行扩增的！因为瞬时离心后，确保反应液全部在毛细管下部，可以排除毛细管有气泡的因素
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2496005
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6楼2010-10-17 12:34:00
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by taigongzaici at 2010-10-17 09:07:49:
1.加样不准确
2。气泡作祟
3，你这是一个模板的重复？还是不同模板你没做重复，只是预实验


建议
1，换成好的枪头和八连管，建议AXYGEN
2，多做重复，最少五个，保证准确性，也可以修正的余地
3，混合分 ...

这个只是预实验，不同模板的，后来每个模板做了3哥重复，还是出现如此状况。我的实验步骤是先把体系的其他样全部加在同一个EP管，然后进行分装，最后加不同的模板（模板量是一样的，加5ul,因为模板稀释过）。反应管不是八连管，只是进口的单个毛细管。机子是罗氏的LightCycler2.0.
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7楼2010-10-17 12:39:36
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sn198651 at 2010-10-21 21:14:17:
2步法的FQ-PCR没做过
我现在都是用一步法的做

2步法的我们只用在常规RT-PCR中
是不是手提RNA不稳定的原因 测过浓度么

RNA是用TRIZOL法提的，跑了个电泳，质量还不错！用紫外分管光度计测了cDNA的浓度，在2000ng/ul左右，后来稀释了个十倍来进行Real-timePCR的
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11楼2010-10-22 10:46:30
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by silicare at 2010-10-22 08:40:30:
CT值稍稍的有一点点的高

把你的重复情况发上来看看，复孔怎么样？

对，CT值是偏高了。后来每个样做了三个重复，也都在30-32之间，平行样的循环数之间相差也在1个循环左右，属于可信范围内的！扩增曲线仍然不太规则。不知道是样品问题还是机器问题。
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12楼2010-10-22 10:52:59
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