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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么用纯化的PCR产物就扩不出来？？？
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luckydong1

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】为什么用纯化的PCR产物就扩不出来？？？ 已有13人参与

各位大侠们好，请教一个问题，同样的基因，用未纯化的PCR产物和克隆质粒做模板都能P出目的片段，可是用胶回收纯化的PCR产物做模板却P不出来，请问是什么原因？望赐教
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1楼 2010-09-29 23:00:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实主要貌似不是乙醇残留的影响，而是PCR产物其实不适合作为模板进行扩增，最好还是从载体载体上扩，而且，你如果是PCR用来以后的连接用的，PCR条带不亮，以后很多后续工作无法完成的，具体PCR产物不适合做PCR模板的原因可能是因为PCR酶的问题，我也没深究，回头找一个很牛的师姐问问，帮你解释下
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14楼2012-12-04 21:44:03
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普通回帖

zking5129

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是有可能在胶回收的时候，乙醇没有晾干或者纯化后模板浓度变的太低了？没遇到过这种情况，只是猜测。
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2楼2010-09-30 08:52:59
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):有这种可能~ 2010-10-09 10:41:52
最大可能 乙醇残留了。

其次  其他操作失误。
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3楼2010-09-30 09:53:29
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也遇到过同样的情况，能P出来，但是量很少。
恳请大虾赐教
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好好学习，天天向上
4楼2010-09-30 12:20:33
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流~ 2010-10-09 10:42:13
如果完全没有条带有可能根本就没回收回来，或者回收回来的条带不对，一般纯化回收的样本要稀释后才能够做普通PCR的样本来使用，否则样本浓度太大了，也扩不好的。乙醇残留也会有影响啦。
你中间有酶切的步骤没，看看是不是酶切的时候酶不好，有核算外切酶活性，把末端切掉啦
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5楼2010-09-30 12:32:09
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
LS是高手
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6楼2010-09-30 16:02:18
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sn198651

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
4楼正解 有可能因为 你的目的片段含量低 片段不亮 回收后都有可能会有损失
导致你回收后什么都没有
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7楼2010-09-30 18:07:57
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luckydong1

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-09-30 12:32:09:
如果完全没有条带有可能根本就没回收回来，或者回收回来的条带不对，一般纯化回收的样本要稀释后才能够做普通PCR的样本来使用，否则样本浓度太大了，也扩不好的。乙醇残留也会有影响啦。
你中间有酶切的步骤没， ...

谢谢指教。我的片段是很亮的，而且没有杂带，回收之后的样本也稀释了十倍才做模板的，但是P出来的是弥散带，这么说来，应该是乙醇残留？？再次谢谢指教
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8楼2010-10-02 09:12:17
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意四楼说的，如果条带很亮，我会稀释1000到10000倍
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9楼2010-10-02 15:46:57
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也遇到过这样的问题，稀释不管用，乙醇残留根本不可能，我都在37度烘箱烘了几个小时。

期待高手解答。
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微生物发酵
10楼2010-10-02 18:58:20
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