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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒提不出来什么原因？
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒提不出来什么原因？已有1人参与

最近连接T载体后，做菌液PCR有目的条带，提质粒跑电泳带很微弱或是没有，但做质粒PCR条带很亮。不知是什么原因。送测序公司，测序公司也说提不出质粒。郁闷中。。。有那位大侠帮帮，不胜感激！
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1楼2010-08-10 16:42:36
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
小虫子666(金币+1): 2010-08-15 09:13:17
小虫子666(金币+1):一人再送个 2010-08-15 09:15:05
很可能是目的片段较长，连接没成功。再做次连接试试。
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3楼2010-08-10 18:18:56
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idealhy

金虫 (小有名气)
小虫子666(金币+1): 2010-08-10 17:17:52
小虫子666(金币+1):和他同一批次做的转化的其他基因都能提出质粒，而且测序正确，但这个就是提不出来，送了4次测序公司也说提不出来。不知原因。 2010-08-10 17:19:56
会不会是质粒浓度不够，pcr只要有几个拷贝就能扩增的，但是提取质粒要大量的。
我个人建议，是否抗生素浓度没控制好或者忘记加了？再就是你质粒抽提的问题。。
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2楼2010-08-10 17:03:02
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
小虫子666(金币+1): 2010-08-15 09:12:58
小虫子666(金币+1):一人再送个 2010-08-15 09:14:48
引用回帖:
Originally posted by 小虫子666 at 2010-08-10 16:42:36:
最近连接T载体后，做菌液PCR有目的条带，提质粒跑电泳带很微弱或是没有，但做质粒PCR条带很亮。不知是什么原因。送测序公司，测序公司也说提不出质粒。郁闷中。。。有那位大侠帮帮，不胜感激！

杂菌的可能性比较大，最好重做。你酶切一下，看看能不能切出来？
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6楼2010-08-13 21:53:57
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麻花13

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 多多交流 2012-03-06 10:51:17
1 建议多做几管，在提取过程前期，每管按照原来的方案添加试剂，然后以此将每管通过一个收集柱，这样就起到了浓缩的作用
2 建议在摇菌时，测一下OD值，当然，在OD到达最高时提质粒最好（以前做过，OD在到达最高后，会下降，表观为菌液变得清澈，并出现絮状沉淀，个人认为只是细菌大规模死亡积聚造成）
3 说了那么多，其实其关键作用的还是菌活力本身，如果不行，建议换菌
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7楼2012-03-06 10:33:47
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