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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】柱上酶切问题
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qzhaiyan

木虫 (著名写手)

小胖子

[交流] 【求助/交流】柱上酶切问题 已有2人参与

我用thrombin酶在Ni柱上酶切GB1蛋白，低浓度咪唑能把GB1蛋白洗脱下来，再用250mM咪唑洗脱目的蛋白，结果蛋白全沉在Ni柱上了，请问这是什么原因啊？
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1楼 2010-08-04 14:59:05
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看不懂LZ的描述

我也是用Thrombin在Ni上酶切目的蛋白。是用20mM咪唑上样，50mM的咪唑washing。然后换到cleavage buffer中，加入Thrombin 4℃下过夜酶切，效果很不错。
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3楼2010-08-04 18:06:31
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noheartman

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是由于酶切后缺少融合蛋白的保护，你的目的蛋白失去稳定的结构而沉淀了啊，融合表达目的蛋白有时候就会遇到这样的情况，我的用thrombin酶切后直接沉淀，如果你的目的蛋白容易聚集或沉淀，建议从头表达或真核吧，也许还有条活路。
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2楼2010-08-04 15:41:12
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