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nnsulei

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】请教高人关于WESTERN-BLOT的一些问题已有8人参与

最近做WESTERN遇到了一些问题，困扰好长时间还请各位高手指点迷津。胶片压出来如下。一抗是去年稀释的，做了N多次出了一两次结果，转膜：2h 350mA. 为什么重复做不出来，而作出来的结果却是这样：

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努力做就有结果～

1楼 2010-07-29 10:57:28

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烟大考研

金虫 (正式写手)

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我做过方法摸索，楼主可以把一些相关参数上传下，帮你简单分析下

nnsulei(金币+1): 2010-08-01 10:02:14

最好把蛋白分子量，膜用的是什么材料的多大孔径的，上传下。既然能出结果就说明楼主的抗体还是可以用的。主要应该还是转移时候出的问题。

我们的蛋白80Kd，用的硝酸纤维素膜或者PVDF膜，推荐PVDF膜本底较浅。

楼主的电流貌似太大了，极有可能转过了。电流一般用0.8-1.5mA/cm2，转移时间45min-90min，楼主这个电流太大了，时间也太长了，建议更换下电流。
转完之后楼主可以将凝胶再染下色，如果没有蛋白残留了，90%可能是转过了。膜也可以用丽春红染下色，如果有色再做，没有色就重新转，节省时间和抗体