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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教高人关于WESTERN-BLOT的一些问题
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nnsulei

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教高人关于WESTERN-BLOT的一些问题 已有8人参与

最近做WESTERN遇到了一些问题，困扰好长时间还请各位高手指点迷津。胶片压出来如下。一抗是去年稀释的 ，做了N多次 出了一两次结果，转膜：2h  350mA. 为什么重复做不出来，而作出来的结果却是这样：
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努力做就有结果～
1楼 2010-07-29 10:57:28
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zhixuec

木虫 (著名写手)
nnsulei(金币+1): 2010-07-29 16:11:12
没有做过蛋白质印迹western-blot，只做过southernblot

先顶起来！

祝你实验顺利！
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酷爱の族
2楼2010-07-29 11:04:41
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noheartman

金虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-07-29 20:44:07
nnsulei(金币+1): 2010-08-03 10:03:51
是不是一抗不行了啊，一抗稀释后很容易长菌的，我55KD的蛋白转膜60分钟就可以了
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3楼2010-07-29 20:33:41
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赵兴延

新虫 (初入文坛)

western blot

也要做这方面的实验，帮楼主顶起来，顺便学东西。
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4楼2010-07-29 20:57:12
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leileihmr

新虫 (初入文坛)
★
lstt09nk(金币+1):一抗最好现用现配 2010-07-30 10:02:41
一抗我们都是我们现用现稀释，有时候可以重复用2-3次。
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5楼2010-07-30 09:46:28
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leileihmr

新虫 (初入文坛)
nnsulei(金币+1): 2010-08-06 11:57:51
电流好像也有点高，那个不是按照膜的大小来计算的么，我们一般用60mA
转1.5h
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6楼2010-07-30 09:51:05
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烟大考研

金虫 (正式写手)

我做过方法摸索，楼主可以把一些相关参数上传下，帮你简单分析下

nnsulei(金币+1): 2010-08-01 10:02:14
最好把蛋白分子量，膜用的是什么材料的多大孔径的，上传下。既然能出结果就说明楼主的抗体还是可以用的。主要应该还是转移时候出的问题。

我们的蛋白80Kd，用的硝酸纤维素膜或者PVDF膜，推荐PVDF膜本底较浅。

楼主的电流貌似太大了，极有可能转过了。电流一般用0.8-1.5mA/cm2，转移时间45min-90min，楼主这个电流太大了，时间也太长了，建议更换下电流。
转完之后楼主可以将凝胶再染下色，如果没有蛋白残留了，90%可能是转过了。膜也可以用丽春红染下色，如果有色再做，没有色就重新转，节省时间和抗体
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心信其可行，则移山填海之难，终有成功之日；心信其不可行，则反掌折枝之易，亦无收效之期
7楼2010-07-30 10:04:21
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elyn-yu

木虫 (初入文坛)
一抗的问题吧，时间太长了
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8楼2010-07-30 13:05:08
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先确定是不是一抗的问题，其次我认为你的这个有可能是转过了，看看膜后面的滤纸上有没有蛋白
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9楼2012-07-09 22:26:13
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shabz

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以把胶切得大块点 防止你因为跑胶过了而导致不在你预期的位置条带
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10楼2013-05-21 08:27:11
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