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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5'-RACE求助 已有2人参与

最近一直在做RACE,3'还比较幸运,一次就OK了,但是5'做了近一月了,还是不行。用的是clontech的SMARTer,已经设计了三四条引物了,基本上都是弥散,做了两个巢式,也是弥散...RNA的18s要比28s亮些,但是完整性还不错,有没可能是5'接头没接上呢?引物感觉设计的还可以的,基本上都符合说明书上的要求,PCR体系和程序都是用的说明书上推荐的,现在真是不知道该再怎么做了,请各位虫友帮忙分析一下,不胜感激了!
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

lianyi1989(金币+1): 2010-07-26 21:22:00
提醒几个小地方,如果都注意到了,应该没有问题。
1、单独添加SMARTer II A Oligonucleotide是5RACE不同于3RACE的地方
2、引物设计的模板链是和3RACE互补的那条链
3、如果基因丰度低的,5RACE会比3RACE难做一些,一般需要做巢式PCR,注意巢式PCR使用NUP引物,效果比UPM好。也可以在目的条带处切胶(指条带浅或者弥散状态),做二次PCR

另外,四条引物,应该有六个巢式PCR,建议你都做一下,我做的RACE,巢式的结果都相当的理想。
2楼2010-07-26 21:16:44
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

谢谢你的回复!前两点应该都注意到了,关于第三点巢式引物的,两条引物可以有重叠吗?还有,巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧,第二轮用NUP,是么?
3楼2010-07-26 21:28:24
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

lianyi1989(金币+1): 2010-07-27 10:37:22
引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2010-07-26 21:28:24:
谢谢你的回复!前两点应该都注意到了,关于第三点巢式引物的,两条引物可以有重叠吗?还有,巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧,第二轮用NUP,是么?

是第二轮用NUP。
两个引物有重叠也没有问题的,NUP就是个有重叠的巢式引物,对吧
4楼2010-07-26 21:58:04
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-26 21:58:04:


是第二轮用NUP。
两个引物有重叠也没有问题的,NUP就是个有重叠的巢式引物,对吧

谢谢回复~我再多试几个巢式吧~
5楼2010-07-27 10:38:05
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qwertY23

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
看似简单的race 操作起来 其实有很多问题  比如我们公司帮别人做的时候,也常出现不能做出来的情况,当然,试剂盒是个关键,祝你成功
实验代做,技术服务,race,DGGE,wb,QPCR.流式及免疫组化
6楼2011-12-23 09:25:58
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shaquila

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
我的经验是不要用他的内侧引物NUP,我一直都是用ump!
7楼2011-12-23 10:21:10
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2442281楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-23 10:21:10
我的经验是不要用他的内侧引物NUP,我一直都是用ump!

请问3RACE第二轮UPM的浓度多少?
Dripping Concentrated!!energetic and active!
8楼2013-01-09 11:00:07
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suguolian

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-26 21:16:44
提醒几个小地方,如果都注意到了,应该没有问题。
1、单独添加SMARTer II A Oligonucleotide是5RACE不同于3RACE的地方
2、引物设计的模板链是和3RACE互补的那条链
3、如果基因丰度低的,5RACE会比3RACE难做一些, ...

请问提取完总RNA可以先合成cDNA第一链保存-20冰箱,一星期再用可以吗?我的5‘引物哈i没合成,但是要先做3’的,提取了RNA怕放久了会降解。请大侠指导……
9楼2013-10-02 13:47:34
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