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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5'-RACE求助
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5'-RACE求助 已有2人参与

最近一直在做RACE，3'还比较幸运，一次就OK了，但是5'做了近一月了，还是不行。用的是clontech的SMARTer，已经设计了三四条引物了，基本上都是弥散，做了两个巢式，也是弥散...RNA的18s要比28s亮些，但是完整性还不错，有没可能是5'接头没接上呢？引物感觉设计的还可以的，基本上都符合说明书上的要求，PCR体系和程序都是用的说明书上推荐的，现在真是不知道该再怎么做了，请各位虫友帮忙分析一下，不胜感激了！
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1楼 2010-07-26 21:01:14
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-07-27 10:37:22
引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2010-07-26 21:28:24:
谢谢你的回复！前两点应该都注意到了，关于第三点巢式引物的，两条引物可以有重叠吗？还有，巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧，第二轮用NUP，是么？

是第二轮用NUP。
两个引物有重叠也没有问题的，NUP就是个有重叠的巢式引物，对吧
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4楼2010-07-26 21:58:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-07-26 21:22:00
提醒几个小地方，如果都注意到了，应该没有问题。
1、单独添加SMARTer II A Oligonucleotide是5RACE不同于3RACE的地方
2、引物设计的模板链是和3RACE互补的那条链
3、如果基因丰度低的，5RACE会比3RACE难做一些，一般需要做巢式PCR，注意巢式PCR使用NUP引物，效果比UPM好。也可以在目的条带处切胶（指条带浅或者弥散状态），做二次PCR

另外，四条引物，应该有六个巢式PCR，建议你都做一下，我做的RACE，巢式的结果都相当的理想。
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2楼2010-07-26 21:16:44
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
谢谢你的回复！前两点应该都注意到了，关于第三点巢式引物的，两条引物可以有重叠吗？还有，巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧，第二轮用NUP，是么？
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3楼2010-07-26 21:28:24
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-26 21:58:04:


是第二轮用NUP。
两个引物有重叠也没有问题的，NUP就是个有重叠的巢式引物，对吧

谢谢回复~我再多试几个巢式吧~
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5楼2010-07-27 10:38:05
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