应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5'-RACE求助
51/1返回列表
查看: 2858  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5'-RACE求助 已有2人参与

最近一直在做RACE，3'还比较幸运，一次就OK了，但是5'做了近一月了，还是不行。用的是clontech的SMARTer，已经设计了三四条引物了，基本上都是弥散，做了两个巢式，也是弥散...RNA的18s要比28s亮些，但是完整性还不错，有没可能是5'接头没接上呢？引物感觉设计的还可以的，基本上都符合说明书上的要求，PCR体系和程序都是用的说明书上推荐的，现在真是不知道该再怎么做了，请各位虫友帮忙分析一下，不胜感激了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-07-26 21:01:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

suguolian

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-26 21:16:44
提醒几个小地方，如果都注意到了，应该没有问题。
1、单独添加SMARTer II A Oligonucleotide是5RACE不同于3RACE的地方
2、引物设计的模板链是和3RACE互补的那条链
3、如果基因丰度低的，5RACE会比3RACE难做一些， ...

请问提取完总RNA可以先合成cDNA第一链保存-20冰箱，一星期再用可以吗？我的5‘引物哈i没合成，但是要先做3’的，提取了RNA怕放久了会降解。请大侠指导……
赞一下 回复此楼
9楼2013-10-02 13:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

yujiaping1

木虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-07-26 21:22:00
提醒几个小地方，如果都注意到了，应该没有问题。
1、单独添加SMARTer II A Oligonucleotide是5RACE不同于3RACE的地方
2、引物设计的模板链是和3RACE互补的那条链
3、如果基因丰度低的，5RACE会比3RACE难做一些，一般需要做巢式PCR，注意巢式PCR使用NUP引物，效果比UPM好。也可以在目的条带处切胶（指条带浅或者弥散状态），做二次PCR

另外，四条引物，应该有六个巢式PCR，建议你都做一下，我做的RACE，巢式的结果都相当的理想。
赞一下 回复此楼
2楼2010-07-26 21:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lianyi1989

金虫 (小有名气)
谢谢你的回复！前两点应该都注意到了，关于第三点巢式引物的，两条引物可以有重叠吗？还有，巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧，第二轮用NUP，是么？
赞一下 回复此楼
3楼2010-07-26 21:28:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-07-27 10:37:22
引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2010-07-26 21:28:24:
谢谢你的回复！前两点应该都注意到了，关于第三点巢式引物的，两条引物可以有重叠吗？还有，巢式pcr的话第一轮应该还是用UPM吧，第二轮用NUP，是么？

是第二轮用NUP。
两个引物有重叠也没有问题的，NUP就是个有重叠的巢式引物，对吧
赞一下 回复此楼
4楼2010-07-26 21:58:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭