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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆连接时间
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xiaoru2010

[交流] 【求助/交流】克隆连接时间 已有11人参与

问一下大家做克隆的时候，一般多少度连接多长时间啊？我用的是PMD19-T载体，上次16度连了23小时，有个1000多的片段还是没连上，菌液PCR出现好多条带……PS：貌似PGEM-T载体25度时间长了什么也连不上
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1楼 2010-06-23 11:16:17
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by wywangying169 at 2010-06-23 11:29:22:

以前做克隆的时候，用的载体是PMD18，一般是16度连接过夜，也就是大概14个小时左右。现在在用一个试剂盒，载体是PEAY-T3，只要连接五分钟就可以了！

好强的载体？单卖多少钱a?
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4楼2010-06-23 11:37:36
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by walker2898 at 2010-06-23 11:19:57:
我做的连接一般是在4度和16度连接12小时，但是不是用你说的这个载体。

先四后16吗？还是4或16？一共12小时？
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5楼2010-06-23 11:38:25
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 段家一凡 at 2010-06-23 12:00:00:
其实连接一般1-2小时就够了，太长可能还有副作用

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。
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13楼2010-06-23 15:20:51
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2010-06-23 13:31:41:
16度连接过夜（12-16h）。连接不上还应该考虑载体与目的片段之间的比例（通常是1：3-10）

我就是载体1，目的片段3，载体只多不少，PMD和PGEM都是这样
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14楼2010-06-23 15:25:05
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-23 15:07:20:
16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。 比例1：3
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15楼2010-06-23 15:42:25
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