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caimingying

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】RNA中DNA污染物的去除 Fermentas的DNase I

fermentas 的DNASE1 RNA最好用DNase处理一下，于是订购了Fermentas的DNase I，（因为逆转录盒子也是Fermentas）可一看说明有点傻眼，本来是想找点捷径，简化DNase消化，可是体系是这样建议的：
Add to an RNase-free tube:
RNA 1μg
10X reaction buffer with MgCl2 1μl
DEPC-treated Water (#R0601) to 9μl
Deoxyribonuclease I (DNase I), RNase-free (1u/μl) 1μl (1u)
Note
If larger amounts of DNA-free RNA are required, the reaction
mixture should be scaled up.
Ribonuclease inhibitor (typically 1u/μl) can also be included in
the reaction mixture to prevent RNA degradation.
Incubate at 37°C for 30 minutes.
Add 1μl 25mM EDTA and incubate at 65°C for 10 minutes. RNA hydrolyzes during heating in the absence of a chelating agent (4).
Use the prepared RNA as a template for reverse
transcriptase.
这样的话即便是RNA模板取1ug，那消化的这个体系也要配到11ul了，可是后面的逆转录盒子却也不允许呀，如下：
Template RNA total RNA 0.1-5 μg
oligo (dT)18 primer 1 μl
DEPC-treated water to 12 μl
Total volume 12 μl
这样的话，如果要是RNA模板采用1ug的话，那就不知怎么加入到逆转录体系了，量太大了，再者消化的体系会不会对逆转录有影响呢，因为Fermentas的盒子并没有说明这个问题

试剂盒里说可以直线扩大体系 然后用苯酚氯仿处理后再用乙醇洗
所以我就想知道除了以上方法 有没有什么更简便的方法可以处理
如果实在没有 ，用苯酚氯仿处理后再用乙醇具体操作和条件是怎么样的，能否告之
因为很急着要用 麻烦大家了 谢谢哈
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1楼 2010-05-27 22:06:10
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