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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒提取后酶切不动
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查看: 2007  |  回复: 10
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donghuayang

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒提取后酶切不动 已有10人参与

我提取的质粒按照正规操作完成，可就是酶切不完全，即使是48小时以后也不能完全酶切，请问谁知道会是什么原因呢？谢谢
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读万卷书，不如行万里路；行万里路，不如阅人无数。
1楼 2010-05-22 23:07:55
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-24 22:54:25
酶切其实受的影响因素挺多的，加大酶的使用量或者改善一下缓冲液的体系。
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2楼2010-05-22 23:12:03
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sushang

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-24 22:54:32
需要注意一些细节：比如，先加DNA， 后加缓冲溶液，再加酶；
温度是否是酶切的最适温度等；
再者 酶是否可以内切你的质粒？
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3楼2010-05-23 00:06:34
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
donghuayang(金币+1):是的，我也出现过从一个菌株提取出来的质粒转化到另外的菌种里边去后提取出的质粒不正常 2010-05-23 13:06:47
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-24 22:54:40
可能的原因：
使用了非克隆菌株。DNA发生甲基化等修饰
使用了不常用的酶，如SacII，这种酶因未知的原因对某些本应是别的序列确实切不开。
酶的活性有问题。是不是加多了（甘油太多会影响活性），或是酶本身有问题。使用NEB的酶切一下试试。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
4楼2010-05-23 01:32:13
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hiking8715

金虫 (小有名气)
donghuayang(金币+1):也有可能 2010-05-23 13:07:05
也有可能酒精没挥发干净
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5楼2010-05-23 09:13:23
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fywjp

木虫 (正式写手)
这个不好说啊，看看你用的酶的说明书，条件有什么不一样吧
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6楼2010-05-23 09:46:11
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一米天堂

铜虫 (小有名气)
影响因素很多，自己先慢慢摸索，可以找λDNA切下，看看酶是否有问题。
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一米天堂
7楼2010-05-24 20:29:00
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Atalpha

木虫 (著名写手)
把质粒纯化一下，通常都是质粒不纯造成的
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8楼2010-05-24 20:42:09
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mourning

木虫 (正式写手)
质粒鉴定过吗？设计个引物看看
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9楼2010-05-24 21:46:16
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主
donghuayang(金币+1):谢谢，不过我的那酶切48小时都无法改变，可能和你说的意思就是Solution 2有问题吧。 2010-05-25 10:02:13
还有一种可能是提取的时候造成质粒结构的部分改变，导致部分质粒无法被酶识别
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10楼2010-05-25 08:27:38
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