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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建一直构建不出来
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

[求助] 载体构建一直构建不出来 已有1人参与

我最近在做载体构建，片段3.2k，载体3k，一直得不到阳性克隆（菌液通用引物PCR无目的条带，只有非特异性扩增），可排除酶切问题，因为我用同一个载体同时连接的一个800bp的片段一次成功，想知道载体构建为什么不成功？可以如何改进？

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
1楼 2017-04-05 21:21:01
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知了啊啊

新虫 (初入文坛)
换个连接酶试试，还有验证的时候可以提质粒酶切，菌P有时候不太靠谱。

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4楼2017-04-05 22:57:12
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知了啊啊

新虫 (初入文坛)
片段大了确实不好连，可以试着连接的时候加大目的片段的比例。筛选重组子的时候长多少摇多少。

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2楼2017-04-05 22:51:44
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lusandanooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 知了啊啊 at 2017-04-05 22:51:44
片段大了确实不好连，可以试着连接的时候加大目的片段的比例。筛选重组子的时候长多少摇多少。

尝试过1:10的比例，挑40个单克隆也没阳性

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
3楼2017-04-05 22:53:15
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
你这个是TA克隆吗

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5楼2017-04-06 09:11:26
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