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lusandanooo

银虫 (小有名气)

[求助] 载体构建一直构建不出来 已有1人参与

我最近在做载体构建,片段3.2k,载体3k,一直得不到阳性克隆(菌液通用引物PCR无目的条带,只有非特异性扩增),可排除酶切问题,因为我用同一个载体同时连接的一个800bp的片段一次成功,想知道载体构建为什么不成功?可以如何改进?

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
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知了啊啊

新虫 (初入文坛)

片段大了确实不好连,可以试着连接的时候加大目的片段的比例。筛选重组子的时候长多少摇多少。

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2楼2017-04-05 22:51:44
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 知了啊啊 at 2017-04-05 22:51:44
片段大了确实不好连,可以试着连接的时候加大目的片段的比例。筛选重组子的时候长多少摇多少。

尝试过1:10的比例,挑40个单克隆也没阳性

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
3楼2017-04-05 22:53:15
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知了啊啊

新虫 (初入文坛)

换个连接酶试试,还有验证的时候可以提质粒酶切,菌P有时候不太靠谱。

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4楼2017-04-05 22:57:12
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原来,是这样

金虫 (小有名气)

5楼2017-04-06 09:11:26
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议你换同源重组吧,成功率高,一次成功,省的在构建质粒这里浪费时间
与人玫瑰手有余香
6楼2017-04-06 14:58:51
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xiao陆

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-06 14:58:51
建议你换同源重组吧,成功率高,一次成功,省的在构建质粒这里浪费时间

请问同源重组怎么弄啊?
7楼2017-04-09 21:22:53
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xiao陆

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-06 14:58:51
建议你换同源重组吧,成功率高,一次成功,省的在构建质粒这里浪费时间

请问同源重组怎么弄啊?
8楼2017-04-10 16:17:18
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