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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR溶解曲线分析
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fenghuwuyu

木虫 (正式写手)

懒

[求助] 荧光定量PCR溶解曲线分析已有2人参与

溶解曲线上62-63℃有峰出现是怎么回事，引物BLAST了特异性比较强，做了标曲也有梯度趋势，而且空白对照也有CT出现（大于35），引物污染经过重复试验也被排除

荧光定量PCR溶解曲线分析
熔解曲线.jpg


荧光定量PCR溶解曲线分析-1
标曲.jpg
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信不信由你
1楼2016-12-22 09:15:32
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fenghuwuyu

木虫 (正式写手)

懒
引用回帖:
2楼: Originally posted by peitaokong at 2016-12-22 12:32:52
出现这种情况，有两种可能。一个就是引物的非特异性扩增，63℃这个峰图代表的引物二聚体的等非特异性扩增条带。第二个可能就是RNA提取过程中乙醇类物质没有晾干，影响了后来的反转录，导致模板的质量不好，进而导致 ...

我用的是DNA直接qPCR,所以应该不存在乙醇等杂质干扰和反转录问题。

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信不信由你
3楼2017-01-29 09:36:21
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-01-30 22:19:21
出现这种情况，有两种可能。一个就是引物的非特异性扩增，63℃这个峰图代表的引物二聚体的等非特异性扩增条带。第二个可能就是RNA提取过程中乙醇类物质没有晾干，影响了后来的反转录，导致模板的质量不好，进而导致扩增的溶解曲线很差。不知道你这个是属于这两种情况的哪一种。至于你说的blast特异性和这个扩增的特异性他们是没有必然的联系的。blast只是理论上的，blast特异型好，只能说明理论上你这个引物不会扩增到别的同源性序列上，并不表示你这个引物在实际上就不会有出非特异性扩增。希望能够帮助你。
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2楼2016-12-22 12:32:52
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yabing0324

金虫 (职业作家)
直接用DNA做的？我当时用质粒

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4楼2017-01-29 09:45:32
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seascen2016

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-01-30 22:19:45
这个结果不是十分可信，前面63℃处应该是引物二聚体，blast很特异只能证明理论上没有非特异，但对于有没有引物二聚体要看你引物设计的怎么样了。你可以试着上调退火温度再看看。你说的空白对照有ct值，它的融解曲线什么样呢？跟你目的条带的融解曲线是否一致？另外你阔增产物是多大？这些可以帮助判断是否有污染。

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5楼2017-01-30 20:07:23
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