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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 关于酶切的问题
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天行健071787

金虫 (小有名气)

[求助] 关于酶切的问题 已有6人参与

求解！！！
最近在构建载体时发现用的内切酶AscI就是切不开，载体上该位点序列是正确的，应该怎么办，着急啊，跪求大家提供建议或办法，非常感谢！
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自立自强，永不言败！
1楼 2016-11-18 21:58:28
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
空载体的话用这一个酶单切都切不开吗？

发自小木虫Android客户端
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···
2楼2016-11-18 23:05:17
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fxpckut215
祝福
3楼2016-11-19 13:44:07
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天行健071787

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fxpckut215 at 2016-11-19 13:44:07
祝福

4楼2016-11-21 11:35:53
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longlinbio
祝福
5楼2016-11-21 12:58:40
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010308Jing

木虫 (正式写手)
是不是被修饰过的？实在不行就换个酶吧

发自小木虫Android客户端
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6楼2016-11-21 15:56:18
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General_007

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你怎么知道有没有切开，有没有把酶切后纯化回收的载体转入DH5a或者TOP10，看看能不能长出了，如果长不出来，就应该切开了，
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7楼2016-11-22 15:45:32
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天行健071787

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by General_007 at 2016-11-22 15:45:32
你怎么知道有没有切开，有没有把酶切后纯化回收的载体转入DH5a或者TOP10，看看能不能长出了，如果长不出来，就应该切开了，

检测的时候点了对照的（没有酶切的质粒）
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自立自强，永不言败！
8楼2016-11-22 16:03:11
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yueping

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先看一下您的整个片段上AscI酶切位点有几处，然后调节酶的用量。
另外可以适当延长酶切时间，调节整个酶切体系。建议50ul酶切。
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9楼2016-11-23 13:30:28
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

试试用甲基化酶缺陷的大肠杆菌（jm110）感受态细胞转化再提质粒，切不开有可能是因为酶切位点甲基化引起的。
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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
10楼2016-12-04 21:22:28
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