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天行健071787

金虫 (小有名气)

[求助] 关于酶切的问题 已有6人参与

求解!!!
最近在构建载体时发现用的内切酶AscI就是切不开,载体上该位点序列是正确的,应该怎么办,着急啊,跪求大家提供建议或办法,非常感谢!
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自立自强,永不言败!
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
空载体的话用这一个酶单切都切不开吗?

发自小木虫Android客户端
···
2楼2016-11-18 23:05:17
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祝福
3楼2016-11-19 13:44:07
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天行健071787

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by fxpckut215 at 2016-11-19 13:44:07
祝福

4楼2016-11-21 11:35:53
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祝福
5楼2016-11-21 12:58:40
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010308Jing

木虫 (正式写手)

是不是被修饰过的?实在不行就换个酶吧

发自小木虫Android客户端
6楼2016-11-21 15:56:18
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General_007

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你怎么知道有没有切开,有没有把酶切后纯化回收的载体转入DH5a或者TOP10,看看能不能长出了,如果长不出来,就应该切开了,
7楼2016-11-22 15:45:32
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天行健071787

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by General_007 at 2016-11-22 15:45:32
你怎么知道有没有切开,有没有把酶切后纯化回收的载体转入DH5a或者TOP10,看看能不能长出了,如果长不出来,就应该切开了,

检测的时候点了对照的(没有酶切的质粒)
自立自强,永不言败!
8楼2016-11-22 16:03:11
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yueping

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先看一下您的整个片段上AscI酶切位点有几处,然后调节酶的用量。
另外可以适当延长酶切时间,调节整个酶切体系。建议50ul酶切。
9楼2016-11-23 13:30:28
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

试试用甲基化酶缺陷的大肠杆菌(jm110)感受态细胞转化再提质粒,切不开有可能是因为酶切位点甲基化引起的。
知识就像蒲公英的花儿一样,播种在世界的每一个角落。
10楼2016-12-04 21:22:28
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