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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)

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[交流] 毕赤酵母诱导表达问题

前期我用Pme I酶线性化pPICZaA载体后进行电转SMD1168酵母菌株，挑单菌落，经特异性引物与通用引物验证后均为阳性克隆子。在YPD活化后转接到50ml BMGY中进行扩大培养，当OD600达3.0时进行菌体沉淀，移入100ml BMMY中诱导表达。但是诱导好几次都没有表达出蛋白。后面重新换了线性化位点（Sac I)，再一次构建酵母表达菌株，验证后进行诱导表达，还是表达不出蛋白。请教各位做酵母表达的前辈，帮忙分析下有可能是什么原因造成的呢？

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1楼2016-09-30 11:50:54

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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

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引用回帖:

11楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:38:20
我的蛋白之前师姐已经有在酵母表达过了，我只是突变了跟师姐不同的位点。关于线性化，都有电泳检测，而且是有切开的，回收后也测了溶度的。转化后有进行阳性子筛选，然后再活化，扩大培养，最后再进行诱导表达。对 ...

我说的小量表达就是个筛选的过程。原来我做酵母用PCR鉴定发现不靠谱，有的P不出来的做小量表达可以表达的出来，相反能P出来的不一定能表达。我那个时候是用的25ml容积的小摇瓶带螺口盖的那种，装个2-3ml培养，也是先培养再转接诱导。