[交流] 毕赤酵母诱导表达问题

8楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-08 15:36:58
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达，有相关文献报道没有？
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果？
3、转化后你是直接表达没有筛选吗？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑几株菌做小量表达， ...

9楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-09 18:07:29
是不是发生移码突变了

10楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-09 18:08:56
你的基因有有优化吗，有可能基因里含有转录提前终止的序列

4楼: Originally posted by ttszero at 2016-10-02 18:14:49
我在ypds平板上活化，酵母比原核麻烦多了，plasmid电转要与基因组重合，不然表达不出来，还要看下酵母本身是否对甲醇敏感的

11楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:38:20
我的蛋白之前师姐已经有在酵母表达过了，我只是突变了跟师姐不同的位点。关于线性化，都有电泳检测，而且是有切开的，回收后也测了溶度的。转化后有进行阳性子筛选，然后再活化，扩大培养，最后再进行诱导表达。对 ...

13楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:40:33
我没有优化呢，但是我有对我的目的基因进行了定点突变。经过序列比对后没有看到转录提前终止的序列呢...

15楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-10 10:38:42
我说的小量表达就是个筛选的过程。原来我做酵母用PCR鉴定发现不靠谱，有的P不出来的做小量表达可以表达的出来，相反能P出来的不一定能表达。我那个时候是用的25ml容积的小摇瓶带螺口盖的那种，装个2-3ml培养，也是 ...

18楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-10 21:47:50
还有一只表达不出来就要考虑换系统，

16楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-10 21:44:28
序列有没有提前终止并不能检测出来
...

13楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:40:33
我没有优化呢，但是我有对我的目的基因进行了定点突变。经过序列比对后没有看到转录提前终止的序列呢...

22楼: Originally posted by 微微皮蛋 at 2018-01-25 21:29:33
楼主，问题解决了吗，我的也是pcr全是阳性，一表达就不行