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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母诱导表达问题
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母诱导表达问题

前期我用Pme I酶线性化pPICZaA载体后进行电转SMD1168酵母菌株，挑单菌落，经特异性引物与通用引物验证后均为阳性克隆子。在YPD活化后转接到50ml BMGY中进行扩大培养，当OD600达3.0时进行菌体沉淀，移入100ml BMMY中诱导表达。但是诱导好几次都没有表达出蛋白。后面重新换了线性化位点（Sac I)，再一次构建酵母表达菌株，验证后进行诱导表达，还是表达不出蛋白。请教各位做酵母表达的前辈，帮忙分析下有可能是什么原因造成的呢？
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1楼2016-09-30 11:50:54
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ttszero

新虫 (小有名气)
★
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
我在ypds平板上活化，酵母比原核麻烦多了，plasmid电转要与基因组重合，不然表达不出来，还要看下酵母本身是否对甲醇敏感的

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4楼2016-10-02 18:14:49
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-10 22:42:47
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达，有相关文献报道没有？
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果？
3、转化后你是直接表达没有筛选吗？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑几株菌做小量表达，有表达了再放大。
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8楼2016-10-08 15:36:58
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244822104

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做蛋白表达，同样也是表达不出来，感觉好痛苦，也希望请教广大虫友
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7楼2016-10-07 12:01:14
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是发生移码突变了

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9楼2016-10-09 18:07:29
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
你的基因有有优化吗，有可能基因里含有转录提前终止的序列

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10楼2016-10-09 18:08:56
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-08 15:36:58
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达，有相关文献报道没有？
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果？
3、转化后你是直接表达没有筛选吗？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑几株菌做小量表达， ...

我的蛋白之前师姐已经有在酵母表达过了，我只是突变了跟师姐不同的位点。关于线性化，都有电泳检测，而且是有切开的，回收后也测了溶度的。转化后有进行阳性子筛选，然后再活化，扩大培养，最后再进行诱导表达。对于小量表达，我可以怎么做呢？请求指导一下
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11楼2016-10-10 09:38:20
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-09 18:07:29
是不是发生移码突变了

可是也没有，因为的有序列比对过，没什么问题。就是做了好几个月，一直出不来。
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12楼2016-10-10 09:39:23
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-09 18:08:56
你的基因有有优化吗，有可能基因里含有转录提前终止的序列

我没有优化呢，但是我有对我的目的基因进行了定点突变。经过序列比对后没有看到转录提前终止的序列呢
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13楼2016-10-10 09:40:33
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ttszero at 2016-10-02 18:14:49
我在ypds平板上活化，酵母比原核麻烦多了，plasmid电转要与基因组重合，不然表达不出来，还要看下酵母本身是否对甲醇敏感的

酵母就是麻烦很多，但是我的蛋白之前我师姐做的好 好的，也能表达出来。到我就不行了
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14楼2016-10-10 09:44:10
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:38:20
我的蛋白之前师姐已经有在酵母表达过了，我只是突变了跟师姐不同的位点。关于线性化，都有电泳检测，而且是有切开的，回收后也测了溶度的。转化后有进行阳性子筛选，然后再活化，扩大培养，最后再进行诱导表达。对 ...

我说的小量表达就是个筛选的过程。原来我做酵母用PCR鉴定发现不靠谱，有的P不出来的做小量表达可以表达的出来，相反能P出来的不一定能表达。我那个时候是用的25ml容积的小摇瓶带螺口盖的那种，装个2-3ml培养，也是先培养再转接诱导。
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15楼2016-10-10 10:38:42
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:40:33
我没有优化呢，但是我有对我的目的基因进行了定点突变。经过序列比对后没有看到转录提前终止的序列呢...

序列有没有提前终止并不能检测出来

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16楼2016-10-10 21:44:28
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
连续的A和T可能会造成翻译提前终止

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17楼2016-10-10 21:45:35
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
★
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还有一只表达不出来就要考虑换系统，

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18楼2016-10-10 21:47:50
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-10 10:38:42
我说的小量表达就是个筛选的过程。原来我做酵母用PCR鉴定发现不靠谱，有的P不出来的做小量表达可以表达的出来，相反能P出来的不一定能表达。我那个时候是用的25ml容积的小摇瓶带螺口盖的那种，装个2-3ml培养，也是 ...

我用了三对引物来PCR鉴定，然后P出来的条带都是正确的。还是找不到原因在哪了
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19楼2016-10-14 18:49:29
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-10 21:47:50
还有一只表达不出来就要考虑换系统，

比如说重新换宿主或者重新换载体吗？
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20楼2016-10-14 18:51:16
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-10 21:44:28
序列有没有提前终止并不能检测出来
...

那有什么方法可以检测出来吗？
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21楼2016-10-14 18:52:18
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微微皮蛋

新虫 (初入文坛)
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楼主，问题解决了吗，我的也是pcr全是阳性，一表达就不行

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22楼2018-01-25 21:29:33
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小雅.sky

新虫 (初入文坛)
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您好，求助SMD菌株，可以吗？

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23楼2018-07-25 17:24:00
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xmcsxq0606

新虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by 木子林夕lms at 2016-10-10 09:40:33
我没有优化呢，但是我有对我的目的基因进行了定点突变。经过序列比对后没有看到转录提前终止的序列呢...

需要根据毕赤酵母表达系统优化序列，还有突变的氨基酸也要求优化

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24楼2018-07-26 11:33:57
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12gxtang

新虫 (初入文坛)
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22楼: Originally posted by 微微皮蛋 at 2018-01-25 21:29:33
楼主，问题解决了吗，我的也是pcr全是阳性，一表达就不行

除非提取酵母基因组进行PCR， 直接菌落PCR我个人感觉不是很稳定，有时候有阳性，有时候没有。目的蛋白是EGFP，菌落PCR时有时无，但是都可以观察到荧光。
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25楼2018-10-19 10:58:33
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xhmaohan2楼
2016-10-02 13:59   回复  
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
tzynew3楼
2016-10-02 14:26   回复  
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
just1emper5楼
2016-10-03 22:32   回复  
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
wl200988366楼
2016-10-03 22:40   回复  
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
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