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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母诱导表达问题
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母诱导表达问题

前期我用Pme I酶线性化pPICZaA载体后进行电转SMD1168酵母菌株，挑单菌落，经特异性引物与通用引物验证后均为阳性克隆子。在YPD活化后转接到50ml BMGY中进行扩大培养，当OD600达3.0时进行菌体沉淀，移入100ml BMMY中诱导表达。但是诱导好几次都没有表达出蛋白。后面重新换了线性化位点（Sac I)，再一次构建酵母表达菌株，验证后进行诱导表达，还是表达不出蛋白。请教各位做酵母表达的前辈，帮忙分析下有可能是什么原因造成的呢？
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1楼 2016-09-30 11:50:54
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-10 10:38:42
我说的小量表达就是个筛选的过程。原来我做酵母用PCR鉴定发现不靠谱，有的P不出来的做小量表达可以表达的出来，相反能P出来的不一定能表达。我那个时候是用的25ml容积的小摇瓶带螺口盖的那种，装个2-3ml培养，也是 ...

我用了三对引物来PCR鉴定，然后P出来的条带都是正确的。还是找不到原因在哪了
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19楼2016-10-14 18:49:29
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ttszero

新虫 (小有名气)
★
木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
我在ypds平板上活化，酵母比原核麻烦多了，plasmid电转要与基因组重合，不然表达不出来，还要看下酵母本身是否对甲醇敏感的

发自小木虫IOS客户端
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4楼2016-10-02 18:14:49
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244822104

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做蛋白表达，同样也是表达不出来，感觉好痛苦，也希望请教广大虫友
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7楼2016-10-07 12:01:14
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-10 22:42:47
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达，有相关文献报道没有？
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果？
3、转化后你是直接表达没有筛选吗？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑几株菌做小量表达，有表达了再放大。
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8楼2016-10-08 15:36:58
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