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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)


[交流] 毕赤酵母诱导表达问题

前期我用Pme I酶线性化pPICZaA载体后进行电转SMD1168酵母菌株,挑单菌落,经特异性引物与通用引物验证后均为阳性克隆子。在YPD活化后转接到50ml BMGY中进行扩大培养,当OD600达3.0时进行菌体沉淀,移入100ml BMMY中诱导表达。但是诱导好几次都没有表达出蛋白。后面重新换了线性化位点(Sac I),再一次构建酵母表达菌株,验证后进行诱导表达,还是表达不出蛋白。请教各位做酵母表达的前辈,帮忙分析下有可能是什么原因造成的呢?
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木子林夕lms

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
8楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-08 15:36:58
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达,有相关文献报道没有?
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果?
3、转化后你是直接表达没有筛选吗?我看你都是直接放大的100ml,可以一次多挑几株菌做小量表达, ...

我的蛋白之前师姐已经有在酵母表达过了,我只是突变了跟师姐不同的位点。关于线性化,都有电泳检测,而且是有切开的,回收后也测了溶度的。转化后有进行阳性子筛选,然后再活化,扩大培养,最后再进行诱导表达。对于小量表达,我可以怎么做呢?请求指导一下
11楼2016-10-10 09:38:20
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ttszero

新虫 (小有名气)



木子林夕lms(金币+1): 谢谢参与
我在ypds平板上活化,酵母比原核麻烦多了,plasmid电转要与基因组重合,不然表达不出来,还要看下酵母本身是否对甲醇敏感的

发自小木虫IOS客户端
4楼2016-10-02 18:14:49
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244822104

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也在做蛋白表达,同样也是表达不出来,感觉好痛苦,也希望请教广大虫友
7楼2016-10-07 12:01:14
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-10 22:42:47
1、确定你要表达的蛋白可以在酵母中表达,有相关文献报道没有?
2、你的质粒线性化后有没有电泳检测线性化的效果?
3、转化后你是直接表达没有筛选吗?我看你都是直接放大的100ml,可以一次多挑几株菌做小量表达,有表达了再放大。
8楼2016-10-08 15:36:58
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