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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 在线急等！！！PCR大神！
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雾里看花花开

金虫 (正式写手)

[求助] 在线急等！！！PCR大神！ 已有6人参与

反应体系：50ul
MIX   45ul
引物上、下--各2ul（引物浓度10 uM）
模板质粒--1ul(质粒浓度 50 ng/ul)
PCR程序见图，温度梯度使用60,62,65度
结果见图
==============
请教过别人说是模板浓度太高，但是降低浓度之后也不见改善
引物是刚合成的，应该不会降解吧
现在担心是模板的问题，模板应该在3600b左右，最后一条带大概是在3000bp
急求！！！

在线急等！！！PCR大神！
PCR程序见图


在线急等！！！PCR大神！-1
结果见图---最后一个条带是模板，有点浅


在线急等！！！PCR大神！-2
MARKER III
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我的一生最美好的场景就是遇见你
1楼 2016-09-03 16:40:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

千里两句

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:52
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雾里看花花开 at 2016-09-03 17:32:57
就是擎科的一个，快速扩增的，绿色溶液
...

没有用过，不过这个mix应该是2x的吧，50ul体系只需要25ul即可，其他用水补平

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9楼2016-09-03 17:49:57
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-03 21:57:49
xn8008: 应助指数+1 2016-09-04 13:10:35
质粒浓度太高，一定要稀释个至少几十倍，你想想PCR之前目的片段跑胶就能看见了，再P个30个循环，体系肯定崩溃。
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6楼2016-09-03 17:24:02
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千里两句

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:09
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:11:23
引用回帖:
13楼: Originally posted by 雾里看花花开 at 2016-09-03 17:58:02
好的，谢谢
...

可以参考下
在线急等！！！PCR大神！-3



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14楼2016-09-03 18:04:54
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普通回帖

千里两句

新虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-03 21:58:14
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:14
看看是否GC含量高，如果是这样的话可以考虑加入甘油或者DMSO

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2楼2016-09-03 16:55:41
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千里两句

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:19
或者加入GC enhancer

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3楼2016-09-03 16:56:08
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千里两句

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:24
我一般质粒模板加入的量仅仅是10ng

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4楼2016-09-03 16:58:23
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雾里看花花开

金虫 (正式写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:28
引用回帖:
2楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 16:55:41
看看是否GC含量高，如果是这样的话可以考虑加入甘油或者DMSO

好的，马上试试

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我的一生最美好的场景就是遇见你
5楼2016-09-03 17:14:10
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千里两句

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:42
引用回帖:
5楼: Originally posted by 雾里看花花开 at 2016-09-03 17:14:10
好的，马上试试
...

你用的是什么mix，让大家看看，好给你做分析

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7楼2016-09-03 17:29:12
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雾里看花花开

金虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 17:29:12
你用的是什么mix，让大家看看，好给你做分析
...

就是擎科的一个，快速扩增的，绿色溶液

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我的一生最美好的场景就是遇见你
8楼2016-09-03 17:32:57
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千里两句

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-03 21:58:36
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-04 13:10:57
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雾里看花花开 at 2016-09-03 17:32:57
就是擎科的一个，快速扩增的，绿色溶液
...

还有如果是要得到目的片段为什么不用高保真的酶？而是用mix呢？如果是普通的taq虽然高效但不保真，出现了碱基突变那不是麻烦了

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10楼2016-09-03 17:53:32
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