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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接在载体上的片段如何判断正反向
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简简单单-婧

新虫 (小有名气)
已领完
连接在载体上的片段如何判断正反向
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最近扩了一个基因，连接T载后，送去测序了！结果是正向的，可是我要反向的，除了双酶切鉴定还有其他方法吗？小妹刚刚开始做，还望大神相助！！！

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1楼 2016-05-08 00:29:44
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缨络瑾

金虫 (著名写手)
没抢到。。。。

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7楼2016-05-08 00:30:48
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以用PCR，选正向引物primer在载体plasmid, 反向引物primer在插入片段即可。

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8楼2016-05-08 00:58:23
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zliean

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
载体正向加目的片段反向

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9楼2016-05-08 09:08:44
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
两个办法
1、菌落PCR，上游引物在载体上，下游引物在片段上，如果反向插入，应该PCR不出来，正项插入的PCR条带大小与你的片段差不多；
2、双酶切质粒，一个酶切位点在载体上，一个在片段上（别再中间），根据切下来的大小判断方向。
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10楼2016-05-08 12:30:51
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简简单单-婧

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by rdfu510 at 2016-05-08 00:58:23
可以用PCR，选正向引物primer在载体plasmid, 反向引物primer在插入片段即可。

好哒，谢谢！

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11楼2016-05-14 00:11:59
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简简单单-婧

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zliean at 2016-05-08 09:08:44
载体正向加目的片段反向

我回去试试，我之前用载体正向引物加目的片段正向引物，pcr出来结果都有！

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12楼2016-05-14 00:14:09
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简简单单-婧

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 12:30:51
两个办法
1、菌落PCR，上游引物在载体上，下游引物在片段上，如果反向插入，应该PCR不出来，正项插入的PCR条带大小与你的片段差不多；
2、双酶切质粒，一个酶切位点在载体上，一个在片段上（别再中间），根据切下 ...

好哒，谢谢！我有用菌落pcr，是用载体的正向引物跟片段的正向引物去做，可是结果出来都有！我同时做的载体上的引物有两个是载体自连，所以不懂为什么？

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13楼2016-05-14 00:18:09
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长弓氏2楼
2016-05-08 00:29   回复  
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goutuizhi3楼
2016-05-08 00:29   回复  
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唯我独尊秒杀4楼
2016-05-08 00:29   回复  
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立群5楼
2016-05-08 00:29   回复  
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scorpiowchy6楼
2016-05-08 00:29   回复  
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