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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
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I-Believe

新虫 (小有名气)

[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！
先说下自己试验步骤吧：
1、构建载体，测序鉴定正确
2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2
5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达




毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
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1楼2016-04-01 16:29:09
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主做的怎么样啦？我也在做，一开始筛选的阳性转化子都能表达，保了甘油菌，过了三四个月，竟然都不表达了！pPICZaA载体，菌株GS115，PCR验证目的基因是在的，希望能和高手们交流一下！
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23楼2016-08-23 08:54:22
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

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3楼2016-04-01 16:37:39
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2016-04-01 16:37:39
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

pPIC载体，启动子没问题。

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4楼2016-04-01 17:08:29
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粒粒分明

新虫 (初入文坛)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
我也是做酵母的，从胶上看，是不是蛋白浓度低？请问你的体系多大？

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5楼2016-04-01 19:21:35
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素黑好好学习

新虫 (初入文坛)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
稀有密码子的问题有没有考虑过呢？

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8楼2016-04-01 21:32:12
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Cathering_w

新虫 (正式写手)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
上样量的问题是否考虑过

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9楼2016-04-01 22:23:46
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 粒粒分明 at 2016-04-01 19:21:35
我也是做酵母的，从胶上看，是不是蛋白浓度低？请问你的体系多大？

上样20微升

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10楼2016-04-02 11:05:53
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 素黑好好学习 at 2016-04-01 21:32:12
稀有密码子的问题有没有考虑过呢？

优化的也做了

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11楼2016-04-02 11:06:19
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tableman

木虫之王 (文学泰斗)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
祝好了。
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13楼2016-04-04 12:19:29
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lksyb

金虫 (正式写手)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
用的什么质粒啊？转化后菌落只有个位数的话，感觉这步可能有问题。另外你的抗菌肽有办法测定活性吗？先确定一下是表达量低还是无表达

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14楼2016-04-04 12:26:29
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baicai734

禁虫 (小有名气)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
15楼2016-04-04 12:29:10
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by baicai734 at 2016-04-04 12:29:10
检测一下活性看看

是一种方法，可以试下

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16楼2016-04-04 23:33:59
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lksyb at 2016-04-04 12:26:29
用的什么质粒啊？转化后菌落只有个位数的话，感觉这步可能有问题。另外你的抗菌肽有办法测定活性吗？先确定一下是表达量低还是无表达

谢谢你的建议，尝试下吧，总比一个人没有一点头绪好

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17楼2016-04-04 23:34:57
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fevil

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有没有可能是没有整合到基因组上去呢？对你做的，很感兴趣，有机会可以交流交流，

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18楼2016-04-05 00:13:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1.转化只长几个转化子绝对不正常，问题就在这里，筛查一下菌株和转化条件有没有问题吧！

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19楼2016-04-05 03:28:14
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by fevil at 2016-04-05 00:13:51
有没有可能是没有整合到基因组上去呢？对你做的，很感兴趣，有机会可以交流交流，

鉴定有些转化子还是整合上了。是通过交叉引物和AOX做菌落PCR。
也希望可以相互交流

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20楼2016-04-05 11:15:37
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by luwei13566 at 2016-04-05 03:28:14
1.转化只长几个转化子绝对不正常，问题就在这里，筛查一下菌株和转化条件有没有问题吧！

请问筛选菌株什么意思？是转化子还是感受态菌株

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21楼2016-04-05 11:21:40
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lksyb at 2016-04-04 12:26:29
用的什么质粒啊？转化后菌落只有个位数的话，感觉这步可能有问题。另外你的抗菌肽有办法测定活性吗？先确定一下是表达量低还是无表达

表达载体是pPIC

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22楼2016-04-05 11:25:23
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kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
遇到同样问题，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA进行表达。宿主也用了X33和GS115。对表达盒测序没问题，转入的X33经基因组DNA的PCR，再测序，也有目的基因。就是没抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大肠做为指示菌）....
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24楼2016-08-30 08:34:57
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kang139com

新虫 (初入文坛)
我转化后，基本都有接近上百个转化子。
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25楼2016-08-30 08:36:43
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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24楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同样问题，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA进行表达。宿主也用了X33和GS115。对表达盒测序没问题，转入的X33经基因组DNA的PCR，再测序，也有目的基因。就是没抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大肠做为指示菌）....

你的培养基和诱导条件是什么？诱导完怎么处理的表达液？有没有浓缩或者进行别的处理？我也用过pGAPZaA的载体，用YPD诱导，没有表达，pPICZaA是BMGY/BMMY，刚转化长出的单克隆有表达，时间久了就不表达了。
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26楼2016-08-30 08:51:32
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kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你有没有做抑菌实验？
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27楼2016-08-30 08:51:52
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kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-30 08:51:32
你的培养基和诱导条件是什么？诱导完怎么处理的表达液？有没有浓缩或者进行别的处理？我也用过pGAPZaA的载体，用YPD诱导，没有表达，pPICZaA是BMGY/BMMY，刚转化长出的单克隆有表达，时间久了就不表达了。...

都是按照毕赤酵母的诱导条件，不过我有对pGAPZaA的进行补料！甲醇诱导额额就是按照说明书～但是，我的由始至终都没抑菌圈！我直接用上清做抑菌实验，电泳则用了上清和丙酮沉淀来浓缩～

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28楼2016-08-30 09:02:57
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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27楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:51:52
你有没有做抑菌实验？

做了，但不是抑菌圈，是稀释一定的大肠杆菌，和表达液混合，作用一段时间，涂板看个数
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29楼2016-08-30 09:03:16
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kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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29楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-30 09:03:16
做了，但不是抑菌圈，是稀释一定的大肠杆菌，和表达液混合，作用一段时间，涂板看个数...

你是标准方法吗？实验结果会不会有误差？

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30楼2016-08-30 09:12:03
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kang139com

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
30楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 09:12:03
你是标准方法吗？实验结果会不会有误差？
...

你的重组菌基本培养了多久？

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31楼2016-08-30 09:13:00
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kang139com

新虫 (初入文坛)
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29楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-30 09:03:16
做了，但不是抑菌圈，是稀释一定的大肠杆菌，和表达液混合，作用一段时间，涂板看个数...

重组菌培养了多少时间～

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32楼2016-08-30 09:13:44
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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30楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 09:12:03
你是标准方法吗？实验结果会不会有误差？
...

不知道是不是标准方法，但操作简单，每次做都会有对照，也做平行，我只要检测这批表达的有没有活性。
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33楼2016-08-30 15:28:00
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
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24楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同样问题，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA进行表达。宿主也用了X33和GS115。对表达盒测序没问题，转入的X33经基因组DNA的PCR，再测序，也有目的基因。就是没抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大肠做为指示菌）....

你密码子优化了吗？
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34楼2016-08-30 15:29:01
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我转化GS115后，菌液PCR鉴定都没有目的带，做了一百多个都没有
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35楼2016-08-30 16:34:05
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huyan0817

木虫 (正式写手)
★
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你的蛋白是否含有跨膜蛋白？如果有的话很难表达，另外如果你的蛋白好表达的话，就算整合率低也会表达，你的蛋白是否有办法检测呢？

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36楼2016-08-30 17:45:52
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kang139com

新虫 (初入文坛)
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34楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-30 15:29:01
你密码子优化了吗？...

优化了～

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37楼2016-08-31 00:23:28
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
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35楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2016-08-30 16:34:05
我转化GS115后，菌液PCR鉴定都没有目的带，做了一百多个都没有

电转还是化学转化？我用的LiCl转化，每次加2ug的线性化质粒都会长上百个，而且大部分都是阳性。
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38楼2016-08-31 15:49:20
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么么哒0120

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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37楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-31 00:23:28
优化了～
...

胞内检测了吗？如果确定自己每一步都没有错误，那应该就是不表达了，或许不适合这个表达系统。我之前一直用酿酒酵母做的，怎么都不表达，所以换的毕赤酵母。
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39楼2016-08-31 15:53:31
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kang139com

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★
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39楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-31 15:53:31
胞内检测了吗？如果确定自己每一步都没有错误，那应该就是不表达了，或许不适合这个表达系统。我之前一直用酿酒酵母做的，怎么都不表达，所以换的毕赤酵母。...

那倒是没做胞内的～

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40楼2016-08-31 16:43:17
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么么哒0120

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40楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-31 16:43:17
那倒是没做胞内的～
...

载体转化的时候用的哪个限制性内切酶线性化？
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41楼2016-09-02 14:02:24
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kang139com

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引用回帖:
41楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-09-02 14:02:24
载体转化的时候用的哪个限制性内切酶线性化？...

AVRII BglII

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42楼2016-09-02 15:09:08
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harry007

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电泳上样量太少了

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43楼2016-09-03 22:42:10
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木子林夕lms

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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23楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-23 08:54:22
请问楼主做的怎么样啦？我也在做，一开始筛选的阳性转化子都能表达，保了甘油菌，过了三四个月，竟然都不表达了！pPICZaA载体，菌株GS115，PCR验证目的基因是在的，希望能和高手们交流一下！

请问一下你现在表达出来了吗？我跟你一样的情况，从5月份开始一直就在做表达，到现在还是没有成功。
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44楼2016-10-14 21:17:38
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木子林夕lms

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24楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同样问题，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA进行表达。宿主也用了X33和GS115。对表达盒测序没问题，转入的X33经基因组DNA的PCR，再测序，也有目的基因。就是没抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大肠做为指示菌）....

我用是的pPICZaA进行表达，宿主是SMD1168。一直不表达，想问下你现在表达了吗？
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45楼2016-10-14 21:19:19
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菜头Q

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23楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-23 08:54:22
请问楼主做的怎么样啦？我也在做，一开始筛选的阳性转化子都能表达，保了甘油菌，过了三四个月，竟然都不表达了！pPICZaA载体，菌株GS115，PCR验证目的基因是在的，希望能和高手们交流一下！

保存甘油菌时如果甘油浓度过大是会引起插入片段缺失的
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46楼2017-12-13 13:57:00
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微微皮蛋

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楼主，请问问题怎么解决的

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47楼2018-01-25 22:54:46
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www1223

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主后来成功了吗？

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48楼2018-03-22 10:09:43
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Xuxuxuing

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主最终怎么解决的？
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49楼2021-06-06 16:18:32
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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49楼: Originally posted by Xuxuxuing at 2021-06-06 16:18:32
请问楼主最终怎么解决的？

酵母表达小的抗菌肽还是蛮好表达的
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50楼2021-06-06 17:02:14
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冷雁孤旅2楼
2016-04-01 16:36   回复  
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qi 发自小木虫Android客户端
两脚泥day6楼
2016-04-01 19:44   回复  
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YX要努力7楼
2016-04-01 20:01   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
阿尔法XMC12楼
2016-04-04 12:09   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
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