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毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
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本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。 目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！ 先说下自己试验步骤吧： 1、构建载体，测序鉴定正确 2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。 3、X33感受态制备 4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2 5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板 6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低 7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR 8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。 9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀 10、结果NOTHING!!!!! 问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达   IMG_20160329_202711.jpg |
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 质粒表达 |
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23楼2016-08-23 08:54:22
3楼2016-04-01 16:37:39
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10楼2016-04-02 11:05:53
11楼2016-04-02 11:06:19
13楼2016-04-04 12:19:29
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用的什么质粒啊？转化后菌落只有个位数的话，感觉这步可能有问题。另外你的抗菌肽有办法测定活性吗？先确定一下是表达量低还是无表达 发自小木虫Android客户端 |
14楼2016-04-04 12:26:29
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15楼2016-04-04 12:29:10
16楼2016-04-04 23:33:59
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26楼2016-08-30 08:51:32
27楼2016-08-30 08:51:52
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都是按照毕赤酵母的诱导条件，不过我有对pGAPZaA的进行补料！甲醇诱导额额就是按照说明书～但是，我的由始至终都没抑菌圈！我直接用上清做抑菌实验，电泳则用了上清和丙酮沉淀来浓缩～ 发自小木虫Android客户端 |
28楼2016-08-30 09:02:57
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你的蛋白是否含有跨膜蛋白？如果有的话很难表达，另外如果你的蛋白好表达的话，就算整合率低也会表达，你的蛋白是否有办法检测呢？ 发自小木虫Android客户端 |
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冷雁孤旅2楼
2016-04-01 16:36
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qi 发自小木虫Android客户端
两脚泥day6楼
2016-04-01 19:44
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YX要努力7楼
2016-04-01 20:01
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祝福 发自小木虫Android客户端
阿尔法XMC12楼
2016-04-04 12:09
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I-Believe(金币+1): 谢谢参与
