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I-Believe

新虫 (小有名气)


[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽,做了几十次了,一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手,从开始什么都不知道,到现在碰到各种问题,试验操作上一些问题还可以看看论坛解决,但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达,在毕赤酵母做了几十次了,菌落PCR鉴定是阳性,诱导表达还是不表达,现在已经没有做实验的激情了!!!
先说下自己试验步骤吧:
1、构建载体,测序鉴定正确
2、线性化载体,乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击:电压2000V,电容25uF,电阻200,时间2
5、加山梨醇28度静置1h,涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子,效率太低了,自己也尝试过提高DNA浓度,但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板,长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导,甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题:1怎么提高转化效率;2怎么改进鉴定是否表达




毕赤酵母表达抗菌肽,做了几十次了,一直不表达
IMG_20160329_202711.jpg
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)


qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

发自小木虫Android客户端
3楼2016-04-01 16:37:39
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I-Believe

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2016-04-01 16:37:39
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

pPIC载体,启动子没问题。

发自小木虫Android客户端
4楼2016-04-01 17:08:29
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粒粒分明

新虫 (初入文坛)



I-Believe(金币+1): 谢谢参与
我也是做酵母的,从胶上看,是不是蛋白浓度低?请问你的体系多大?

发自小木虫IOS客户端
5楼2016-04-01 19:21:35
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素黑好好学习

新虫 (初入文坛)



I-Believe(金币+1): 谢谢参与
稀有密码子的问题有没有考虑过呢?

发自小木虫IOS客户端
8楼2016-04-01 21:32:12
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简单回复
2016-04-01 16:36   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
qi 发自小木虫Android客户端
2016-04-01 19:44   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫IOS客户端
2016-04-01 20:01   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
2016-04-04 12:09   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
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