应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
51/1返回列表
查看: 7198  |  回复: 49
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

I-Believe

新虫 (小有名气)

[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！
先说下自己试验步骤吧：
1、构建载体，测序鉴定正确
2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2
5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达




毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
IMG_20160329_202711.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

质粒表达

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2016-04-01 16:29:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang139com

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
41楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-09-02 14:02:24
载体转化的时候用的哪个限制性内切酶线性化？...

AVRII BglII

发自小木虫Android客户端
回复此楼
42楼2016-09-02 15:09:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 50 个回答

冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-04-01 16:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2016-04-01 16:37:39
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

pPIC载体，启动子没问题。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-04-01 17:08:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

粒粒分明

新虫 (初入文坛)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
我也是做酵母的，从胶上看，是不是蛋白浓度低？请问你的体系多大？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-04-01 19:21:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
冷雁孤旅2楼
2016-04-01 16:36   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
qi 发自小木虫Android客户端
两脚泥day6楼
2016-04-01 19:44   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫IOS客户端
YX要努力7楼
2016-04-01 20:01   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
阿尔法XMC12楼
2016-04-04 12:09   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
查看全部 50 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭