24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

I-Believe

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 284.3
帖子: 60
在线: 17.5小时
虫号: 2823714

[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！
先说下自己试验步骤吧：
1、构建载体，测序鉴定正确
2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2
5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达

IMG_20160329_202711.jpg

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

质粒表达

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有99人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

关于用酵母表达的设计引物问题已经有0人回复
生物技术各种实验protocol征集已经有55人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2016-04-01 16:29:09

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

么么哒0120

铜虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 464.6
帖子: 93
在线: 20.7小时
虫号: 2460662

引用回帖:

24楼: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同样问题，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA进行表达。宿主也用了X33和GS115。对表达盒测序没问题，转入的X33经基因组DNA的PCR，再测序，也有目的基因。就是没抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大肠做为指示菌）....

你密码子优化了吗？