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I-Believe

新虫 (小有名气)

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[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！
先说下自己试验步骤吧：
1、构建载体，测序鉴定正确
2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2
5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达

IMG_20160329_202711.jpg

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1楼 2016-04-01 16:29:09

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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

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★
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引用回帖:

23楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-23 08:54:22
请问楼主做的怎么样啦？我也在做，一开始筛选的阳性转化子都能表达，保了甘油菌，过了三四个月，竟然都不表达了！pPICZaA载体，菌株GS115，PCR验证目的基因是在的，希望能和高手们交流一下！

保存甘油菌时如果甘油浓度过大是会引起插入片段缺失的