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毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
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本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。 目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！ 先说下自己试验步骤吧： 1、构建载体，测序鉴定正确 2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。 3、X33感受态制备 4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2 5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板 6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低 7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR 8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。 9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀 10、结果NOTHING!!!!! 问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达   IMG_20160329_202711.jpg |
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