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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
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I-Believe

新虫 (小有名气)

[交流] 毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达

本人是做毕赤酵母表达抗菌肽的新手，从开始什么都不知道，到现在碰到各种问题，试验操作上一些问题还可以看看论坛解决，但是这种表达不出来就不知道怎么解决了。
目的蛋白已经在大肠杆菌成功表达，在毕赤酵母做了几十次了，菌落PCR鉴定是阳性，诱导表达还是不表达，现在已经没有做实验的激情了！！！
先说下自己试验步骤吧：
1、构建载体，测序鉴定正确
2、线性化载体，乙醇沉淀回收、凝胶回收、DNA纯化试剂盒回收都做过。
3、X33感受态制备
4、电击：电压2000V，电容25uF，电阻200，时间2
5、加山梨醇28度静置1h，涂抗生素终浓度100的YPDS平板
6、培养2、3天只能长个位数的转化子，效率太低了，自己也尝试过提高DNA浓度，但是还是效率低
7、挑单菌落划抗性平板，长出菌落后再做菌落PCR
8、鉴定阳性就BMGY/BMMY培养诱导，甲醇浓度1%。
9、SDS-PAGE鉴定上清和沉淀
10、结果NOTHING!!!!!
问题：1怎么提高转化效率；2怎么改进鉴定是否表达




毕赤酵母表达抗菌肽，做了几十次了，一直不表达
IMG_20160329_202711.jpg
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1楼 2016-04-01 16:29:09
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kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-08-30 08:51:32
你的培养基和诱导条件是什么？诱导完怎么处理的表达液？有没有浓缩或者进行别的处理？我也用过pGAPZaA的载体，用YPD诱导，没有表达，pPICZaA是BMGY/BMMY，刚转化长出的单克隆有表达，时间久了就不表达了。...

都是按照毕赤酵母的诱导条件，不过我有对pGAPZaA的进行补料！甲醇诱导额额就是按照说明书～但是，我的由始至终都没抑菌圈！我直接用上清做抑菌实验，电泳则用了上清和丙酮沉淀来浓缩～

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28楼2016-08-30 09:02:57
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

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3楼2016-04-01 16:37:39
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I-Believe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2016-04-01 16:37:39
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

pPIC载体，启动子没问题。

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4楼2016-04-01 17:08:29
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粒粒分明

新虫 (初入文坛)
★
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
我也是做酵母的，从胶上看，是不是蛋白浓度低？请问你的体系多大？

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5楼2016-04-01 19:21:35
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冷雁孤旅2楼
2016-04-01 16:36   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
qi 发自小木虫Android客户端
两脚泥day6楼
2016-04-01 19:44   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
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YX要努力7楼
2016-04-01 20:01   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
阿尔法XMC12楼
2016-04-04 12:09   回复  
I-Believe(金币+1): 谢谢参与
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