先了解一下你的化合物是不是存在异构体？有几个手性中心或者有无顺反异构？如果这些情况存在之一，先用二级管阵列检测器走个样品，调取你两个没有分开的峰的UV图谱对比，是否一致？如果一致，那就是异构体了，不同批次的产品中两个异构体的比例达到接近1：1时，可能就是你分不开的情况，浅略地说了一下，也可能是其它因素造成的，仅供参考一下吧，

通常是柱子的问题，换个柱子试一试？

首先排除是否是两个异构体，如果是纯物质，分离度很小，峰型不好，分叉，这种可能是流动相pH不合适，也可能是柱子不行了，先换个同型号新柱子尝试下。