你可以试着分段P，然后拿overlap连起来

做引物的大片段没有问题的话，换一管模板质粒试试吧，另外质粒浓度要准确，我们一般不超过30ng，加多了DpnI不好切。

不知道你的片段有多大，质粒当模板的话，至少得稀释个几百几千倍。

我也是，质粒之前也是能扩增出来，现在同样的条件又不能了。

第一种情况，留在胶孔不出来，很可能是交联在一起了，在跑胶加孔之前，95℃ 5min加热变性，缓慢降温，然后后进行跑胶即可。

第二种情况，后面扩增不出来，考虑是否DNA分解，重新提取质粒。加入质粒之前测一下浓度，质粒的拷贝数一般不宜过高，模板过高也会抑制反应。 此外，长片段扩增可以尝试其他酶试试，比如takara GXL，